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極低温超偏極固体NMRによる蛋白質の動的機能構造解析法の開発とGPCRへの応用

低温超极化固态NMR蛋白质动态功能结构分析方法的开发及其在GPCR中的应用

基本信息

批准号：
20H03193
负责人：
松木陽
金额：
$ 11.48万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

最終標的蛋白質のGPCR（β2アドレナリン受容体）について、無細胞系発現・精製・調製法を確立した。DOPC-コレステロール膜リポソームへの再構成、ラジオリガンドアッセイによるリガンド結合活性も確認した。固体NMR試料管へのパッキングを向上するのに、脂質量の最適化が必要であった。リガンドの結合に伴う構造変化を最も反映するヒンジ部位への選択的同位体標識スキームも設計し、主に主鎖構造アンサンブル平衡の観測に供する。これと並行してセレノメチオニン選択標識法も確立し、プロトン観測2次元 77Se-NMR信号の解析から、側鎖の構造アンサンブルに迫るアプローチも実行、学会発表した。GPCR以外の分子系で、やはり構造アンサンブルの動的平衡が機能発現に関与するモデル系として多剤排出系転写因子QacRの発現、精製も行った。QacRの微結晶状試料について、13C相関スペクトルの解析から動的平衡の存在が側鎖信号に捉えられることを見出し、学会発表した。高次元・残基間相関用のラジオ波パルス列も完成し、観測信号の質向上を目指した最適化を行った。装置の長期・超・安定性を得るために、微小な磁場不均一性を補正するシム電源の改良が必要であることも見出した。構造アンサンブルの計算科学的解析法については、データベースマイニングに則る基礎的な手法を確立し、モデル系αシヌクレインの液液相分離（LLPS）状態ドロップレット中の構造アンサンブル解析に応用した。成果は複数の学会発表、また論文として公表した。よりGPCRの解析に有用な解析法に発展させるため、DFTに基づく化学シフト計算をデータ解析に直接組み込む改良も行った。以上より、モデル系、標的蛋白質試料ともに試料調製、DNP-固体NMR測定法、解析法、いずれについても計画に沿って順調に発展させ、膜蛋白質の二重膜中、構造アンサンブル解析の基盤を作った。

The most important protein, GPCR (β 2), cell line, cell line and cell line. The DOPC- film is used to improve the quality of the film. The activity of the film is confirmed. The solid NMR material pipe is in good condition, and the amount of fat is the most necessary. The combination of the system and the partner system most effectively reflects the identity of the selected part of the system, and the host creates a balance device for the system. At the same time, make sure that the header is set up, that the two-dimensional 77Se-NMR signal is parsed, and that you are forced to do so, and learn to read the table. In addition to the GPCR, the balance mechanism of the molecular system and the system can be detected and analyzed. The QacR factor is detected and analyzed. QacR microcrystalline materials and 13C phase micrographs are used to analyze the balance of motions. there is a signal to catch the signals, and learn to read the table. The high-dimensional residual phase is completed by the transmission wave train, and the signal is directed up to the most accurate line. Long-term stability of the device, small magnetic field heterogeneity is necessary to improve the power source. In order to calculate the analytical method of science, the method of determining the accuracy of the computer science, the method of determining the accuracy of the computer, the method of determining the accuracy of the system, and the method of liquid-liquid separation (LLPS) in the state of liquid-liquid separation (LPLD). The results of the "plural" society "table," the text "public table". GPCR analysis is useful in the development of chemical calculations, DFT chemistry, chemical calculation, and analysis. The above materials, DNP- solid-state NMR, analytical methods, membrane proteins in double membranes, membrane proteins in double membranes, and analytical methods.