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極低温超偏極固体NMRによる蛋白質の動的機能構造解析法の開発とGPCRへの応用

低温超极化固态NMR蛋白质动态功能结构分析方法的开发及其在GPCR中的应用

基本信息

批准号：
20H03193
负责人：
松木陽
金额：
$ 11.48万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

最終標的蛋白質のGPCR（β2アドレナリン受容体）について、無細胞系発現・精製・調製法を確立した。DOPC-コレステロール膜リポソームへの再構成、ラジオリガンドアッセイによるリガンド結合活性も確認した。固体NMR試料管へのパッキングを向上するのに、脂質量の最適化が必要であった。リガンドの結合に伴う構造変化を最も反映するヒンジ部位への選択的同位体標識スキームも設計し、主に主鎖構造アンサンブル平衡の観測に供する。これと並行してセレノメチオニン選択標識法も確立し、プロトン観測2次元 77Se-NMR信号の解析から、側鎖の構造アンサンブルに迫るアプローチも実行、学会発表した。GPCR以外の分子系で、やはり構造アンサンブルの動的平衡が機能発現に関与するモデル系として多剤排出系転写因子QacRの発現、精製も行った。QacRの微結晶状試料について、13C相関スペクトルの解析から動的平衡の存在が側鎖信号に捉えられることを見出し、学会発表した。高次元・残基間相関用のラジオ波パルス列も完成し、観測信号の質向上を目指した最適化を行った。装置の長期・超・安定性を得るために、微小な磁場不均一性を補正するシム電源の改良が必要であることも見出した。構造アンサンブルの計算科学的解析法については、データベースマイニングに則る基礎的な手法を確立し、モデル系αシヌクレインの液液相分離（LLPS）状態ドロップレット中の構造アンサンブル解析に応用した。成果は複数の学会発表、また論文として公表した。よりGPCRの解析に有用な解析法に発展させるため、DFTに基づく化学シフト計算をデータ解析に直接組み込む改良も行った。以上より、モデル系、標的蛋白質試料ともに試料調製、DNP-固体NMR測定法、解析法、いずれについても計画に沿って順調に発展させ、膜蛋白質の二重膜中、構造アンサンブル解析の基盤を作った。

The final target protein GPCR (β2 receptor) was established by cell-free development, purification and modulation methods. DOPC-C-C-C Solid state NMR sample preparation and optimization of lipid quality are essential. The combination structure of the first and second elements is changed to reflect the isotope identification of the first and second elements. The main lock structure is changed to reflect the measurement of the first and second elements. The analysis of 77Se-NMR signals and the structural analysis of 77Se-NMR signals are carried out by using the selective identification method. Molecular systems other than GPCR are involved in the development and refinement of QacR, a multi-agent ejection system, and the balance of structural and dynamic functions. QacR micro-crystalline sample, 13C correlation analysis of the existence of dynamic equilibrium, side lock signal detection, learning to show High dimensional inter-residue correlation is used to optimize the quality of the signal. It has been demonstrated that in order to achieve long-term ultra-stability of the device, improvements in the system power supply are necessary to correct for minute magnetic field inhomogeneities. The analytical method of computational science for structural analysis is used to establish the basic method of liquid-liquid separation (LLPS) of structural analysis. The results of the study are presented in a number of papers. The analysis of GPCR can be carried out by analytical method, DFT can be used for chemical calculation, and the analysis can be directly combined with improved method. The above mentioned methods include: preparation of sample, DNP-solid state NMR measurement, analytical method, preparation of protein sample, development of protein sample along the sequence, double membrane of membrane protein, structure analysis of protein sample.