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極低温超偏極固体NMRによる蛋白質の動的機能構造解析法の開発とGPCRへの応用

低温超极化固态NMR蛋白质动态功能结构分析方法的开发及其在GPCR中的应用

基本信息

批准号：
20H03193
负责人：
松木陽
金额：
$ 11.48万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

最終標的蛋白質のGPCR（β2アドレナリン受容体）について、無細胞系発現・精製・調製法を確立した。DOPC-コレステロール膜リポソームへの再構成、ラジオリガンドアッセイによるリガンド結合活性も確認した。固体NMR試料管へのパッキングを向上するのに、脂質量の最適化が必要であった。リガンドの結合に伴う構造変化を最も反映するヒンジ部位への選択的同位体標識スキームも設計し、主に主鎖構造アンサンブル平衡の観測に供する。これと並行してセレノメチオニン選択標識法も確立し、プロトン観測2次元 77Se-NMR信号の解析から、側鎖の構造アンサンブルに迫るアプローチも実行、学会発表した。GPCR以外の分子系で、やはり構造アンサンブルの動的平衡が機能発現に関与するモデル系として多剤排出系転写因子QacRの発現、精製も行った。QacRの微結晶状試料について、13C相関スペクトルの解析から動的平衡の存在が側鎖信号に捉えられることを見出し、学会発表した。高次元・残基間相関用のラジオ波パルス列も完成し、観測信号の質向上を目指した最適化を行った。装置の長期・超・安定性を得るために、微小な磁場不均一性を補正するシム電源の改良が必要であることも見出した。構造アンサンブルの計算科学的解析法については、データベースマイニングに則る基礎的な手法を確立し、モデル系αシヌクレインの液液相分離（LLPS）状態ドロップレット中の構造アンサンブル解析に応用した。成果は複数の学会発表、また論文として公表した。よりGPCRの解析に有用な解析法に発展させるため、DFTに基づく化学シフト計算をデータ解析に直接組み込む改良も行った。以上より、モデル系、標的蛋白質試料ともに試料調製、DNP-固体NMR測定法、解析法、いずれについても計画に沿って順調に発展させ、膜蛋白質の二重膜中、構造アンサンブル解析の基盤を作った。

The final target protein, GPCR (β2 アドレナリン acceptor), has been developed, and the cell-free system development, purification, and preparation methods have been established. DOPC-コレステロール film リポソームへの was reconstituted and ラジオリガンドアッセイによるリガンド binding activity was confirmed. It is necessary to use the solid NMR sample tube to optimize the lipid quality. The combination of リガンドの合に同うstructural changeをmostも reflects the same position of the するヒンジへの选択The body logo is スキームも designed, and the main lock structure is アンサンブルbalanced and measured. する.これと Parallel してセレノメチオニン选択Marking method もEstablished し、プロトン禳measurement 2D 77Se-NMR signal analysis, side-locking structure analysis, and learning method. The balance and function of molecular systems other than GPCR and the structure of GPCR are shown It is related to the するモデル system and the として multi-emission system, the writing factor QacR and the refined も行った. QacR's microcrystalline sample, 13C related analysis, existence, side lock signal, side locking signal, and learning method. High-dimensional and inter-residue correlations are completed using waveforms, and the quality of the detection signal is improved by the optimization method. The long-term, ultra-high stability of the device has been improved, and the correction of micro magnetic field inhomogeneities and the improvement of the power supply have been necessary. The analytical method of constructing the calculation science of calculation science is established. The liquid-liquid phase separation (LLPS) state of the liquid-liquid phase separation (LLPS) system of the デル system is the structure of the レット中アンサンブルanalytical に応用した. The results are published in the academic journal of the plural society and the public journal of the paper. The analysis method of GPCR is useful, the analysis method is the development method, and the DFT chemistry is the calculation method, and the analysis method is the direct combination method and the improvement method is used. The above より, モデル series, target protein sample and ともに sample preparation, DNP-solid NMR measurement method, analytical method, いずれについてもPlan に Along って Adaptation に発Develop させ, Membrane protein のDouble membrane, Structure アンサンブル ANALYSIS ANALYSIS ANALYSIS ANALYSIS.