Sensitive evaluation method for neurotoxicity using a novel marker

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昨年度までに確立したNRF-1レポーター遺伝子を導入した細胞を用いて，本年度も引き続き各種化学物質のNRF-1活性と細胞毒性評価を行った．特に今年度は神経突起伸長とNRF-1活性，細胞生存の関係を明らかにするため，Neuro2A細胞にNREレポーター遺伝子を導入し，分化誘導剤を添加した状態で実験に用いた．NRF-1活性をレポーターのEGFP緑色で（96ウェルプレートの6ウェルの平均をコントロール群の平均で割って活性を算出），Thermo社 のNeurite Outgrowth Staining Kitを使用し，生細胞をカルセインの青色で，神経突起を赤色で染色し，High Content Screening装置Opera Phenix（Perkin Elmer）を用いて神経突起長などを計測することによるアッセイの自動化を試みた．実験条件を確立するためのモデル化合物としてトリブチルスズ (TBT) を30 nMから3 microMの濃度で用いた．しかしながらNeuro2Aの分化誘導条件の検討などに手間取り，神経突起の自動認識も困難を極めたため，NRF-1, 生細胞，神経突起３者の自動定量化には至らなかった．今後実験系を精査し，アッセイ系を確立する予定である．