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リボソーマルRNA修飾を介した環境応答的な翻訳制御機構の解明

阐明核糖体RNA修饰介导的环境响应翻译控制机制

基本信息

批准号：
20J00947
负责人：
石黒健介
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、リボソームが環境に応じてダイナミックに組成を変化させ、翻訳や細胞の生育を制御することが示唆されつつある。しかし、その詳細な機構は依然としてほとんど明らかとなっていない。本研究では、申請者が大腸菌で同定した嫌気環境特異的な3つのrRNA修飾による翻訳制御機構の解明を進めた。採択前までの申請者の研究により、これらの修飾は嫌気環境依存的に修飾率が上昇し、リボソームの翻訳能を向上させて細胞の生育に寄与することが示唆されていた。また、前年度までの構造学的および生化学的な解析により、3つの修飾がPTCの構造安定化を通じてペプチド転移反応効率を向上させ、嫌気環境での細胞生育に貢献していることが示唆された。また、RlmPの最小基質として23S rRNAのHelix 89を中心とする100base程度のRNAを特定した。本年度は、RlmPの結晶化による構造解析を中心に進めた。当初通常の環境でapo-RlmPを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、タンパク質結晶を得ることはできなかった。そこで、嫌気チャンバー内でholo-RlmPの再構成を行った上で結晶化スクリーニングを行った。その結果、いくつかの条件でタンパク質結晶らしきものを検出することができたが、高解像度の回折像を得ることはできなかった。また、最小基質のRNAを等モル混ぜた条件でも結晶化スクリーニングを行ったが、タンパク質結晶を得ることはできなかった。そこで、Cryo-EMによるRlmPの構造解析を試みた。まず、apo-RlmPについて酵素の基質となるSAMやMeCbl、rRNA最小基質などの添加の有無により幾つか条件を振りgridの作成およびCryo-EMによる試測定を行った。その結果酵素らしき粒子がMicrograph上で確認できたため、現在pickingの条件などの検討を進めている。

In recent years, the environment has changed, and the fertility of cells has changed. The details of the organization remain unchanged. This study aims to clarify the identity of E. coli and its environmental specificities through the modification of rRNA. In the past, the applicant's research has shown that the modification rate of the cell depends on the environment, and the modification rate of the cell can be improved. The structural and biochemical analysis of PTC in the past year shows that the structural stability of PTC is enhanced by the shift of the efficiency of PTC and the contribution of the environment to cell reproduction. The minimum matrix of RlmP is 23S rRNA and the Helix 89 is 100base RNA. This year, the crystallization of RlmP was improved. In general, apo-RlmP is used for crystallization. The re-structuring of holo-RlmP is carried out on the crystallization of holo-RlmP. The result is that the quality of the crystal is very high, and the reflection is very high. The minimum matrix RNA and other conditions for crystallization are discussed. The structural analysis of Cryo-EM RlmP was tried. The substrate of apo-RlmP, SAM, MeCbl, rRNA and the presence or absence of addition of the minimum substrate, the conditions for the preparation of the grid, and the determination of Cryo-EM were determined. The result of the enzyme is that the particles are identified on the Micrograph, and the conditions for picking are discussed.