原発性免疫不全症の遺伝的素因解明に関する研究

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CRISPR/dCas9システムの構築について：pEF1a-BirA-V5-neoおよびpEF1a-FB-dCas9-puroのプラスミドを購入した（Addgene社）。K562に導入したところ、後者は抗FB抗体によって検出されず安定株が得られなかった。そこで、Inducible Caspex expressionプラスミドを新たに購入した。別途THP-1株に患者由来の変異をCRISPR/Cas9を用い変異株を作成し、野生株と変異株THP-1に導入し安定発現株を作成中である。作成後はguide RNAを用い変異付近にdCas9を誘導し、免疫沈降後に蛋白を抽出しproteome解析を行う。Luciferase assayについて：pGL4.10-luciferase2 vectorに、BTK遺伝子のpromoter領域配列や、同配列に加えintron1の3’配列側1029bpおよびExon2の5’側配列の一部を含むものを挿入したものを作成し、B細胞系株とT細胞系株を用い、Luciferase assayを行った。するとSplice異常が示されているExon1のsplice donor siteの変異では転写活性が上がったが、intron1内の変異では活性が明らかに低下し、intron 1内の変異が転写に影響する可能性が示唆された。ZIP7異常症の解析について：B細胞欠損と無ガンマグロブリン血症を呈した女児で認められたSLC39A7遺伝子の複合ヘテロ接合性変異に関して、一方はZIP7のプロテアソーム分解を促進し、もう一方は小胞体上のZIP7の局在に異常をもたらす変異であることを証明した。この遺伝子がコードする蛋白であるZIP7は細胞内小器官から細胞質への亜鉛輸送を担うっており、B細胞分化やそのほかの免疫細胞の成熟・生存に亜鉛動態が重要となる可能性を示唆することができた。