ERK経路の異常活性化によるエクソソーム内miRNAを介した癌化分子機構の解明

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初年度の実験はmiRNAの標的遺伝子予測データベースであるmiRDB・PicTarを利用し、標的となる遺伝子とmiRNAとの結合領域を探索した。同時に、miR-17ファミリーの発現プラスミドを作成し、安定発現株を作製した。標的と予測された遺伝子について、miR－17ファミリーの結合領域をコードしたプラスミドを作製した。miR-17ファミリーの安定発現株を利用し、ルシフェラーゼ・レポーターアッセイにより予測された標的遺伝子と実際に結合するかを評価した。miRNAはmRNAの翻訳を抑制し、分解へ導くことが知られているため、標的とするmRNA量が低下するかをqRT-PCRで評価し、タンパク量が低下するかをウエスタンブロットにより評価した。その結果、これまでにPTEN（Phosphatase and Tensin Homolog）などの癌抑制遺伝子やMAPK経路（Mitogen-Activated Protein Kinase経路）の構成因子を含む8遺伝子まで選抜した。さらに、エクソソームに特異的に含有されるRNAモチーフ配列（Exosome-motif）を同定し、変異型を発現する安定発現株を作製することで特異性の有無を検証した。