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指向性進化を用いた芳香族ポリマー原料生合成経路の構築

利用定向进化构建芳香族聚合物原料生物合成途径

基本信息

批准号：
20J12216
负责人：
小川友希
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではエンジニアリングプラスチックの原料である2,6-xylenolの人工生合成経路の構築を目指した。2,6-xylenolは酸化酵素XylMABCによってわずかに、転写制御因子XylSが認識する3-メチルサリチル酸に変換されるため、XylSによる検出が可能である。そこで、XylSを利用してXylMABCを改変することで、2,6-xylenolから3-メチルサリチル酸への変換効率を向上させ、より高感度な2,6-xylenol検出系の構築に取り組んだ。まず、XylSの制御下に抗生物質耐性遺伝子や蛍光タンパク質遺伝子を配置した遺伝子モチーフを利用して、3-メチルサリチル酸の生産量から変異型XylMの活性を評価する系を構築した。この評価系を用いて変異型XylM活性を評価し、機械学習と組み合わせることで、XylMの指向性進化を行った。これにより変換効率が野生型の20倍に向上した変異型XylMの取得に成功した。転写制御因子による酵素活性の評価系を、機械学習と組み合わせた酵素改変手法はこれまで確立されていなく、本研究で確立した手法は膜タンパク質などのin vitroでの酵素活性評価が困難なタンパク質のように、機械学習の適用が難しいと考えられてきたタンパク質の改変を可能にする先駆的な手法である。また3,5-ジメチルチロシンから2,6-xylenolへの変換を担う変異型TPLを構築し、2,6-xylenol人工生合成経路の下流経路の反応が進行することを実証した。そこで、変異型TPL、変異型XylM、XylABC、XylSを組み合わせた3,5-ジメチルチロシン生産検出システムを利用し、2,6-xylenol人工生合成経路の上流経路の反応を担うメチル基転移酵素SacFの活性評価システムを構築した。今後この系を用いてSacFの改変が可能になることが期待できる。

In this study, we aimed to construct synthetic pathway of 2,6-xylenol from the raw materials of the plant. 2,6-xylenol acidifying enzyme XylMABC, XylS, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, XylS, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylS, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylS, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylS, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylS, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylMABC, 3-methylenol acidifying enzyme XylS, 3-methylenol acidifying enzyme XylS XylS can be used to improve the conversion efficiency of XylMABC, 2,6-xylenol and 3-methylphenol. The construction of high sensitivity XylMABC system can be divided into two groups. To construct a system for evaluating the activity of XylM in the production of XylS, XylS, and XylS. The evaluation of XylM activity, mechanical learning and composition, and the evolution of XylM directivity The conversion rate was 20 times higher than that of wild-type XylM. The enzyme activity evaluation system, mechanical learning and combination of enzyme modification methods in vitro were established. This study established the method of enzyme activity evaluation in vitro. The application of mechanical learning was difficult. The 3,5-xylene conversion from 2,6-xylenol to TPL is supported by the construction of heterotypic TPL, and the reverse reaction of the downstream of the 2,6-xylenol synthetic pathway is demonstrated. The activity evaluation system of SacF was constructed by combining the 3,5-diamino acid production system with TPL, XylM, XylABC and XylS. In the future, it is possible to change the system by using SacF.