疾患特異的iPS細胞を用いた有毛細胞不動毛障害の病態解析

使用疾病特异性 iPS 细胞对毛细胞静纤毛疾病进行病理分析

• 批准号: 20J12301
• 负责人: 佐伯 翼
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J12301/
• 关键词: iPS細胞; 遺伝子変異; 有毛細胞; 不動毛; 難聴; ヒト多能性幹細胞; 内耳; 遺伝性難聴; 再生医療

遺伝子解析技術の進歩により、これまで診断のつかなかった難聴患者から稀な遺伝子変異が見つかるようになってきたが、内耳細胞は身体の奥深くにあり微細な観察ができず、細胞レベルでの病態の発症・進行の評価が困難である。本研究では、音刺激から神経活動への変換を担う内耳有毛細胞不動毛に焦点を当て、不動毛の機能に重要な遺伝子に変異が認められた難聴患者の採血から、iPS細胞の技術で内耳細胞を作製して病態解析を試みる。不動毛の機能を評価するためには、音圧由来の物理刺激に応答して活動電位を生成する機能的に成熟した有毛細胞をiPS細胞から誘導する必要がある。本年度は、ヒト多能性幹細胞由来の内耳前駆細胞から、機能的な有毛細胞を分化誘導する培養条件を探索した。まず、接着培養および三次元培養を組み合わせた培養を行うことで、ヒト多能性幹細胞から高効率で内耳前駆細胞マーカー陽性細胞(SIX1+, PAX2+, PAX8+)を誘導可能であった。また、三次元培養により誘導した内耳前駆細胞について、シングルセル化し、単層培養を行うことで、MYO7A陽性の有毛細胞様細胞が得られた。誘導したMYO7A陽性細胞は、同時にF-actin陽性の有毛細胞に特徴的な不動毛と思われる構造を認めた。さらに、透過型電子顕微鏡による観察の結果、不動毛同士をつなぐ、音刺激の受容に関わるtip link様の構造が確認された。一方で、機能的な不動毛をラベルするFM1-43色素を取り込んたMYO7A陽性細胞数は少なく、成熟した有毛細胞への誘導効率は低いのが現状である。今後は、音刺激に応答する機械受容体を発現する、機能的に成熟した有毛細胞を高効率で誘導する培養条件を確立し、有毛細胞不動毛の発生や機能に関わる遺伝子変異により発症する難聴患者iPS細胞由来の細胞を用いた病態研究に応用する予定である。

遗传分析技术的进步导致听力丧失患者发现了罕见的遗传突变，但以前未被诊断，但是内耳细胞在体内深处，无法详细观察，因此很难评估细胞水平病理学的发作和进展。在这项研究中，我们专注于具有内耳的固定毛细胞，这是导致声音刺激向神经活动的转化，并尝试使用来自听力损失患者的血液收集的IPS细胞技术来分析内耳细胞的病理，这些患者被发现对固定头发的功能具有重要的基因突变。为了评估固定头发的功能，必须从IPS细胞中得出功能成熟的毛细胞，该毛细胞会产生动作电位，以响应于声音压力的物理刺激而产生动作电位。今年，我们探索了诱导来自人类多能干细胞的内耳祖细胞的功能性毛细胞分化的培养条件。首先，通过结合贴生培养物和三维培养物，可以从人类多能干细胞中诱导内耳祖细胞标记阳性细胞（SIX1+，PAX2+，PAX8+），并具有很高的效率。此外，通过三维培养诱导的内耳祖细胞是单细胞的，并进行了单层培养物以获得MyO7A阳性细胞样细胞。诱导的MyO7A阳性细胞同时观察到了一种似乎是F-肌动蛋白阳性毛细胞特征的毛细胞的结构。此外，使用透射电子显微镜的观测确认了连接固定的头发并接收声音刺激的尖端链接的结构。另一方面，结合FM1-43颜料的MyO7a阳性细胞的数量很小，将功能固定的头发标记为固定的头发，并且诱导成熟毛细胞的效率较低。将来，我们计划建立培养条件，以诱导功能成熟的毛细胞，这些细胞表达具有高效率对声刺激的机械感受器，并利用从听力损失患者的IPS细胞中将其应用于病理研究中，这些细胞因与毛细血管细胞的发育和功能相关的基因突变而发展而发展。

项目成果

内耳有毛細胞の製造方法、薬剤の評価方法、及び細胞分化誘導用組成物

内耳毛细胞的制造方法、药物评价方法以及诱导细胞分化的组合物

• 发表时间: 2021

Generation of a common marmoset embryonic stem cell line CMES40-OC harboring a POU5F1 (OCT4)-2A-mCerulean3 knock-in reporter allele

生成含有 POU5F1 (OCT4)-2A-mCerulean3 敲入报告等位基因的常见狨猴胚胎干细胞系 CMES40-OC

• DOI: 10.1016/j.scr.2021.102308
• 发表时间: 2021
• 期刊: Stem Cell Research
• 影响因子: 1.2
• 作者: Yoshimatsu S;Murakami R;Sato T;Saeki T;Yamamoto M;Sasaki E;Noce T;Okano H
• 通讯作者: Okano H

内耳前駆細胞の製造方法、内耳有毛細胞の製造方法、薬剤の評価方法、及び内耳細胞分化 誘導用組成物

内耳祖细胞的制备方法、内耳毛细胞的制备方法、药物评价方法以及诱导内耳细胞分化的组合物

• 发表时间: 2021