DAMPsを標的とした新規がん免疫療法創成の分子基盤の構築

为创建针对 DAMP 的新型癌症免疫疗法奠定分子基础

• 批准号: 20J12432
• 负责人: 衞藤 翔太郎
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J12432/
• 关键词: DAMPs; 腫瘍; NF-κB; マクロファージ; CCL24; Toll-like receptor; ネクローシス; イヌ

昨年度実施したイヌ腫瘍細胞株由来DAMPs添加時のマクロファージ細胞株の遺伝子発現解析結果をもとに、本年度はNF-κBを活性化する新規DAMPの同定を試みた。そこで、NF-κBレポーター遺伝子を恒常発現するマクロファージ細胞株を作製し、壊死細胞上清を添加したところ、いくつかのイヌ腫瘍細胞株およびマウス腫瘍細胞株でNF-κBの強い活性化が認められた。そこで、このレポーター活性を指標に、マウス腫瘍細胞株由来の壊死細胞上清を限外濾過による濃縮、さらに液体クロマトグラフィーによる精製を繰り返したところ、20-30kDaの分画でNF-κBの活性化が認められた。そこで、質量分析によりこの分画に含まれる分子を探索したところ、新規DAMP候補分子として分子Xを同定した。興味深いことに分子Xは細胞質内で作用する分子であり、細胞外での役割は全く報告されていなかった。そこでCRISPR-Cas9によって作製した分子X欠損腫瘍細胞株から壊死細胞上清を作製したところ、これまで確認できていたNF-κBの活性化が完全に消失することがわかった。以上の結果は、細胞壊死に伴って細胞外に放出された分子Xが免疫細胞のNF-κBを活性化し、炎症反応を強く誘導するDAMPsとして機能する可能性を示唆するものである。今後は分子Xのリコンビナントタンパクの作製および分子Xを恒常的に細胞外に分泌する腫瘍細胞株を作製し、これらを用いて分子Xの詳細な炎症誘導メカニズムの検討および腫瘍微小環境における役割の解明を行っていく予定である。

The results of gene expression analysis of cell lines derived from DAMPs added last year and the new regulation of NF-κB activation this year were tested simultaneously. NF-κ B protein is constantly expressed in cell lines, and the supernatant of the cells is added to the supernatant of the cells. The activity of NF-κB was determined by filtration, concentration, purification and 20-30kDa fractionation. The new DAMP candidate molecule X is determined by mass analysis. Molecular X is a cytoplasmic molecule, and extracellular molecule is a full report. CRISPR-Cas9 is the first molecule to be produced in a cell line that lacks the ability to activate NF-κB. These results suggest the possibility of activation of NF-κB and induction of DAMPs associated with cell death and extracellular release. In the future, molecular X will be produced in vitro and secreted in vitro in a constant manner.