直接リプログラミングによるヒト肺細胞分化誘導法の開発

开发通过直接重编程诱导人肺细胞分化的方法

• 批准号: 20J12690
• 负责人: 楠本 竜也
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J12690/
• 关键词: Ⅱ型肺胞上皮細胞; Ⅰ型肺胞上皮細胞; SFTPC; 肺線維芽細胞; レンチウイルス; 直接リプログラミング

採用者は、肺の発生に重要な転写因子15種を候補とし、レンチウイルスを用いてヒト初代肺線維芽細胞に15因子を導入した。誘導効率の上昇を目的に培地に各種増殖因子等の液性因子を加え、7日間の3次元培養を行った。Ⅱ型肺胞上皮細胞の特異的マーカーであるSP-C遺伝子の発現を検討し、コントロールに対しSP-C mRNAの上昇を認めた。そして、15因子の各種因子の組み合わせの検討から特異的3因子が必須であることを見出した。採用者は、qPCRによる誘導細胞における肺マーカー遺伝子発現解析を行った。結果、Ⅱ型及びI型肺胞上皮細胞のマーカー遺伝子発現の上昇を確認し、特異的3因子の導入により、Ⅱ型及びⅠ型肺胞上皮細胞等が混在するヘテロな細胞集団の誘導に成功している可能性が示唆された。次に、SP-C/EGFPリポーター遺伝子(SP-C発現時にEGFP蛍光を発現するリポーター遺伝子)を導入した初代肺線維芽細胞を作成し、レンチウイルスを用いて特異的3因子を導入した。培地に各種増殖因子等の液性因子を加え、2次元培養に移行した。因子導入1日後にはEGFP蛍光陽性の細胞が出現し、導入3日後には全細胞の約54％がEGFP陽性となった。SP-C発現細胞のセルソーティングを行い、ソーティングしたSP-C発現細胞のqPCRによる遺伝子発現解析を行った。結果、Ⅱ型肺胞上皮細胞のマーカー遺伝子であるSFTPC発現の上昇、I型肺胞上皮細胞のマーカー遺伝子であるE-cadherin発現の上昇、線維芽細胞のマーカー遺伝子であるVimentinの発現の低下を確認した。また、誘導細胞からソーティングしたSP-Cの発現細胞の免疫蛍光染色を行い、proSP-Cの蛋白レベルでの発現を確認した。ここまでの実験から、肺線維芽細胞に特異的3因子を導入することで、Ⅱ型及びI型肺胞上皮細胞の直接誘導に成功している可能性が示唆された。

Adopters は, lung の 発 raw に important な planning write factor 15 を alternate と し, レ ン チ ウ イ ル ス を with い て ヒ ト original lung line に 15 d bud cells を import し た. The induction rate <s:1> increased を objective に to cultivate に various <s:1> liquid factors such as growth factors を and え, 7-day <s:1> three-dimensional culture を row った. Ⅱ type of epithelial cells of the lung cell の specific マ ー カ ー で あ る SP - C heritage 伝 son の 発 を now beg し 検, コ ン ト ロ ー ル に し seaborne SP - C mRNA の rise を recognize め た. そ し て, 15 group factor の various factor の み わ せ の 検 please か ら specific が 3 factors must be で あ る こ と を shows し た. Analysis of the occurrence of 伝 offspring in the における lung における カ カ 伝 伝 cells induced by the adopter った and qPCRによる : を rows った. Results, Ⅱ び type I and epithelial cells of the lung cell の マ ー カ ー posthumous son 伝 発 now rising の を confirm し 3 factors, specific の import に よ り, Ⅱ type and び Ⅰ type lung epithelial cells and other cell が mixed in す る ヘ テ ロ な cells sets 団 の induced に successful し て い が る possibility in stopping さ れ た. に, SP - C/EGFP リ ポ ー タ ー heritage 伝 child (SP - C 発 now に EGFP 蛍 light を 発 now す る リ ポ ー タ ー heritage 伝) を import し た original lung line d を bud cells make し, レ ン チ ウ イ ル ス を with い て specific 3 factor を import し た. Youdaoplaceholder0 various growth factors and other <s:1> liquid factors を plus え, two-dimensional culture に migration た た. One day after factor introduction, に に EGFP蛍 photopositive <s:1> cells が showed <s:1>, and three days after introduction, に <s:1> whole cells <s:1> were approximately 54% がEGFP positive となった. SP - C 発 now cells の セ ル ソ ー テ ィ ン グ を い, ソ ー テ ィ ン グ し た SP - C 発 now cells の qPCR に よ る posthumous son 伝 発 now line analytical を っ た. Results, Ⅱ epithelial cells of the lung cell の マ ー カ ー posthumous son 伝 で あ る SFTPC 発 is の rise, type I epithelial cells of the lung cell の マ ー カ ー posthumous son 伝 で あ る E - cadherin 発 の rise now, line d bud cells の マ ー カ ー posthumous son 伝 で あ る Vimentin の 発 now low の を confirm し た. ま た, inducing cell か ら ソ ー テ ィ ン グ し た SP - C の 発 is の immune cells 蛍 light dyeing line を い, proSP - protein C の レ ベ ル で の 発 を now confirmed し た. こ こ ま で の be 験 か ら, pulmonary vascular bud に specific 3 factors を import す る こ と で, Ⅱ type and び type I の directly induce cell lung epithelial cells に successful し て い が る possibility in stopping さ れ た.