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Cooperative mechanism of molecular chaperone complexes revealed by a hybrid approach of paramagnetic NMR and Cryo-EM

顺磁核磁共振和冷冻电镜混合方法揭示分子伴侣复合物的协同机制

基本信息

批准号：
20J20761
负责人：
川越聡一郎
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J20761/
关键词：
分子シャペロン NMR cryo-EM 複合体立体構造

项目摘要

細胞質で合成されたタンパク質の約3割は細胞質外へと輸送されるが、この生体膜をこえるタンパク質輸送においては、複数のシャペロンにより構成されるSec pathwayが主要な役割を担っている。本研究では、Sec pathwayにおける最初のステップである、trigger factor (TF) シャペロンとSecBシャペロンとの複合体形成反応に着目し、TF-SecB複合体の立体構造決定による相互作用様式の解明を目的としている。溶液NMR法、cryo-EM法どちらの測定手法についても、TFとSecBとの解離定数Kdが20 μM程度であることから予想される、TF-SecB複合体の安定性の低さが課題となる。そこで、安定なTF-SecB複合体を取得するため、共発現系によるTF-SecB複合体の調製に着手した。TFとSecBをペプチドリンカーにより連結したTF-SecBとSecB単体を共発現する系を構築し、この2種のベクターのコピー数の制御により、TF-SecBとSecBを1:3の比で発現させることに成功した。その結果、単離精製された目的タンパク質は、SEC-MALS測定により分子質量116 KDaと決定でき、これはSecBの四量体にTFが一分子だけ結合したTFmono-SecBtet複合体であると考えられた。TFmono-SecBtet複合体について高度安定同位体標識法を適用し、 NMR測定を行なった結果、TFとSecBとの間の会合界面に存在するメチル基間のNOE信号の観測に成功し、その構造計算によって、低分解能ながらも複合体構造の算出をすることができた。また、cryo-EMによる構造決定では、複合体全体の三次元密度マップは得られていないものの、部分的な密度マップを取得することには成功した。

Cytoplasmic synthesis is a process involving the formation of a secondary pathway that is responsible for the transport of cytosol to the outside world. The purpose of this study is to clarify the interaction model of TF-SecB complex, which is determined by the three-dimensional structure of TF-SecB complex. Solution NMR and cryo-EM methods are used to determine the stability of TF-SecB complexes. The modulation of TF-SecB complex is initiated by the acquisition of TF-SecB complex and the co-generation system. The TF-SecB unit was successfully developed by linking TF-SecB to SecB in a ratio of 1:3. The results were as follows: 1. The molecular weight of TF-B complex was determined by SEC-MALS. The application of highly stable isotope identification method in TFmono-Sectet complexes, the results of NMR measurements, the existence of convergence interfaces between TF and SecB, the successful detection of NOE signals between TFmono-Sectet complexes, the calculation of structure of TFmono-Sectet complexes, and the calculation of structure of TFmono-Sectet complexes with low resolution energy. The structure determines the three-dimensional density of the complex.