Cooperative mechanism of molecular chaperone complexes revealed by a hybrid approach of paramagnetic NMR and Cryo-EM

細胞質で合成されたタンパク質の約3割は細胞質外へと輸送されるが、この生体膜をこえるタンパク質輸送においては、複数のシャペロンにより構成されるSec pathwayが主要な役割を担っている。本研究では、Sec pathwayにおける最初のステップである、trigger factor (TF) シャペロンとSecBシャペロンとの複合体形成反応に着目し、TF-SecB複合体の立体構造決定による相互作用様式の解明を目的としている。溶液NMR法、cryo-EM法どちらの測定手法についても、TFとSecBとの解離定数Kdが20 μM程度であることから予想される、TF-SecB複合体の安定性の低さが課題となる。そこで、安定なTF-SecB複合体を取得するため、共発現系によるTF-SecB複合体の調製に着手した。TFとSecBをペプチドリンカーにより連結したTF-SecBとSecB単体を共発現する系を構築し、この2種のベクターのコピー数の制御により、TF-SecBとSecBを1:3の比で発現させることに成功した。その結果、単離精製された目的タンパク質は、SEC-MALS測定により分子質量116 KDaと決定でき、これはSecBの四量体にTFが一分子だけ結合したTFmono-SecBtet複合体であると考えられた。TFmono-SecBtet複合体について高度安定同位体標識法を適用し、 NMR測定を行なった結果、TFとSecBとの間の会合界面に存在するメチル基間のNOE信号の観測に成功し、その構造計算によって、低分解能ながらも複合体構造の算出をすることができた。また、cryo-EMによる構造決定では、複合体全体の三次元密度マップは得られていないものの、部分的な密度マップを取得することには成功した。

細胞質で合成されたタンパク質の約3割は細胞質外へと輸送されるが、この生体膜をこえるタンパク質輸送においては、複数のシャペロンにより構成されるSec pathwayが主要な役割を担っている。本研究では、Sec pathwayにおける最初のステップである、trigger factor (TF) シャペロンとSecBシャペロンとの複合体形成反応に着目し、TF-SecB複合体の立体構造決定による相互作用様式の解明を目的としている。溶液NMR法、cryo-EM法どちらの測定手法についても、TFとSecBとの解離定数Kdが20 μM程度であることから予想される、TF-SecB複合体の安定性の低さが課題となる。そこで、安定なTF-SecB複合体を取得するため、共発現系によるTF-SecB複合体の調製に着手した。TFとSecBをペプチドリンカーにより連結したTF-SecBとSecB単体を共発現する系を構築し、この2種のベクターのコピー数の制御により、TF-SecBとSecBを1:3の比で発現させることに成功した。その結果、単離精製された目的タンパク質は、SEC-MALS測定により分子質量116 KDaと決定でき、これはSecBの四量体にTFが一分子だけ結合したTFmono-SecBtet複合体であると考えられた。TFmono-SecBtet複合体について高度安定同位体標識法を適用し、 NMR測定を行なった結果、TFとSecBとの間の会合界面に存在するメチル基間のNOE信号の観測に成功し、その構造計算によって、低分解能ながらも複合体構造の算出をすることができた。また、cryo-EMによる構造決定では、複合体全体の三次元密度マップは得られていないものの、部分的な密度マップを取得することには成功した。