Screening for synthetic lethal partners of mutations in polycomb-related genes

CRISPR-Cas9システムにより、白血病由来細胞株を用いてノックアウトスクリーニングを行った。まずそれぞれの細胞株においてCas9を強制発現させ、さらにポリコーム群複合体関連遺伝子の機能喪失型変異を導入した。特に骨髄異形成症候群において高頻度に変異が報告されているEZH2の機能喪失型変異に着目し、さらにレンチウイルスライブラリーにより種々のsgRNAを導入し、一定期間培養した際のsgRNAのプロファイルについて詳細な解析を行った。その結果、既にEZH2との合成致死性が報告されているARID1Aを始め、いくつかのEZH2との合成致死性を有する候補遺伝子を同定した。これらの結果は個別に設計した候補遺伝子のノックアウトのみで再現されたため、スクリーニングの結果は信頼可能なものであると考えられた。また、樹立したCas9強制発現白血病細胞株を用いて、実臨床で頻用されるDNAメチル化阻害剤（デシタビン、アザシチジン）の存在下で同様のノックアウトスクリーニングを行い、薬剤感受性に関わるいくつかの遺伝子を同定した。候補遺伝子のうち、特定のユビキチンリガーゼが複数の白血病細胞株を用いたスクリーニングにおいて共通して見出だされたため、その作用機序について詳細な解析を行った。質量分析や2次スクリーニングによる基質同定を試み、基質候補のユビキチン化がノックアウト細胞でデシタビンの暴露後に減少することを確認した。細胞株を用いた異種移植モデルや、ノックアウトマウスを用いた生体モデルにおいても、当該遺伝子のノックアウトが薬剤感受性を増大させるかを確認している。

CRISPR-Cas9システムにより、白血病由来細胞株を用いてノックアウトスクリーニングを行った。まずそれぞれの細胞株においてCas9を強制発現させ、さらにポリコーム群複合体関連遺伝子の機能喪失型変異を導入した。特に骨髄異形成症候群において高頻度に変異が報告されているEZH2の機能喪失型変異に着目し、さらにレンチウイルスライブラリーにより種々のsgRNAを導入し、一定期間培養した際のsgRNAのプロファイルについて詳細な解析を行った。その結果、既にEZH2との合成致死性が報告されているARID1Aを始め、いくつかのEZH2との合成致死性を有する候補遺伝子を同定した。これらの結果は個別に設計した候補遺伝子のノックアウトのみで再現されたため、スクリーニングの結果は信頼可能なものであると考えられた。また、樹立したCas9強制発現白血病細胞株を用いて、実臨床で頻用されるDNAメチル化阻害剤（デシタビン、アザシチジン）の存在下で同様のノックアウトスクリーニングを行い、薬剤感受性に関わるいくつかの遺伝子を同定した。候補遺伝子のうち、特定のユビキチンリガーゼが複数の白血病細胞株を用いたスクリーニングにおいて共通して見出だされたため、その作用機序について詳細な解析を行った。質量分析や2次スクリーニングによる基質同定を試み、基質候補のユビキチン化がノックアウト細胞でデシタビンの暴露後に減少することを確認した。細胞株を用いた異種移植モデルや、ノックアウトマウスを用いた生体モデルにおいても、当該遺伝子のノックアウトが薬剤感受性を増大させるかを確認している。