日本紅斑熱リケッチア研究への挑戦：新規ゲノム疫学手法の確立と増殖必須遺伝子の同定

【課題１】qPCRでリケッチアゲノムが検出できた32サンプルを、リケッチアのコピー数を基準にサンプルのライブラリDNAをプールした後、キャプチャー反応によりリケッチアDNAの濃縮を行い、NovaSeqによるシーケンス解析を行なった。得られたリードは、アダプター配列および低クオリティリードの除去を行い、R. japonica YH_M株のゲノム配列にマッピングをした。マップされなかったリードおよび、PCR duplicationと考えられるリードを除去した後、x3以上のdepthでYH_M株のゲノム配列の何％をカバーできているかを調べた。その結果、9サンプルについては94.6%-99.95%をカバーしており、系統解析に利用可能なデータの取得ができたが、７サンプルについてはデータの取得効率が非常に悪いため解析を中止した。残りの16サンプルについてはデータ量を追加するために再度キャプチャーを行い、再シーケンスを行なった。得られたリードを加えて再解析を行ったが、全てのサンプルでデータ量を大量に追加したにもかかわらず、カバー率は期待したようには大きくならなかった。結果的に16サンプル中8サンプルについては、追加シーケンス後のカバー率が低かったため、解析対象から除外することとしたが、残りの8サンプルについては、YH_M株のゲノム配列の87.2-95.3%をカバーする配列データが得られた。1回目のシーケンスで十分なデータが得られた9サンプルと合わせて、計17の臨床検体に含まれる日本紅斑熱リケッチアのゲノム情報に基づいた高精度系統解析を行う予定である。【課題２】昨年度までに取得したRlonのゲノム情報の精査と論文作成を進めるとともに、エレクトロポレーション法による形質転換系の確立に向けて培養条件等の再検討を行なった。リケッチアの培養には時間を要することや啓示的な変化等の確認が必要であることから、この検討には継続的な実験を行う必要がある。

【課題１】qPCRでリケッチアゲノムが検出できた32サンプルを、リケッチアのコピー数を基準にサンプルのライブラリDNAをプールした後、キャプチャー反応によりリケッチアDNAの濃縮を行い、NovaSeqによるシーケンス解析を行なった。得られたリードは、アダプター配列および低クオリティリードの除去を行い、R. japonica YH_M株のゲノム配列にマッピングをした。マップされなかったリードおよび、PCR duplicationと考えられるリードを除去した後、x3以上のdepthでYH_M株のゲノム配列の何％をカバーできているかを調べた。その結果、9サンプルについては94.6%-99.95%をカバーしており、系統解析に利用可能なデータの取得ができたが、７サンプルについてはデータの取得効率が非常に悪いため解析を中止した。残りの16サンプルについてはデータ量を追加するために再度キャプチャーを行い、再シーケンスを行なった。得られたリードを加えて再解析を行ったが、全てのサンプルでデータ量を大量に追加したにもかかわらず、カバー率は期待したようには大きくならなかった。結果的に16サンプル中8サンプルについては、追加シーケンス後のカバー率が低かったため、解析対象から除外することとしたが、残りの8サンプルについては、YH_M株のゲノム配列の87.2-95.3%をカバーする配列データが得られた。1回目のシーケンスで十分なデータが得られた9サンプルと合わせて、計17の臨床検体に含まれる日本紅斑熱リケッチアのゲノム情報に基づいた高精度系統解析を行う予定である。【課題２】昨年度までに取得したRlonのゲノム情報の精査と論文作成を進めるとともに、エレクトロポレーション法による形質転換系の確立に向けて培養条件等の再検討を行なった。リケッチアの培養には時間を要することや啓示的な変化等の確認が必要であることから、この検討には継続的な実験を行う必要がある。