Clarification of the pathological mechanism of HA non-producing Clostridium botulinum.

各OrfXタンパク質の発現解析ボツリヌス菌7I03-H株の各OrfXタンパク質の発現をin vitroにおいて調べた。ビーズ破砕法によって調製したサンプルを用いて、各OrfXタンパク質の発現をポリクローナル抗体によるWestern blottingで調べた。その結果、7I03-H株菌体から各OrfXタンパク質が検出された。したがって、7I03-H株において、OrfX1、OrfX2、OrfX3及びP47タンパク質が発現していることが判明した。7I03-H株の分画方法の検討ボツリヌス菌において発現した各OrfXタンパク質の局在を解析するために分画を試みた。【mutanolysin（N-アセチルムラミダーゼ）を用いた分画】グラム陽性菌は細胞壁分解酵素mutanolysinによる処理と凍結破砕によって各画分を分離することができる（Proc Natl Acd Sci U S A. 2021, Mol Microbiol. 1999）。7I03-H株菌体をmutanolysinで処理しどの画分に各OrfXタンパク質が検出されるかを調べた。その結果、局在の結果が実験毎に異なり、分画時のmutanolysin処理条件では菌の著しい形態変化が観察された。このことから、mutanolysin処理条件が適切でないことが考えられた。【超遠心法を用いた分画】7I03-H株菌体をビーズ破砕したのち超遠心によって細胞膜画分及び細胞質画分に分離した。細胞膜局在のポジティブコントロールとして発現させた鞭毛モータータンパク質MotAタンパク質（Deme JC, et al., Nat Microbiol. 2020.）が膜画分にのみ検出されたことから、適切に分画されていることを確認した。

各OrfXタンパク質の発現解析ボツリヌス菌7I03-H株の各OrfXタンパク質の発現をin vitroにおいて調べた。ビーズ破砕法によって調製したサンプルを用いて、各OrfXタンパク質の発現をポリクローナル抗体によるWestern blottingで調べた。その結果、7I03-H株菌体から各OrfXタンパク質が検出された。したがって、7I03-H株において、OrfX1、OrfX2、OrfX3及びP47タンパク質が発現していることが判明した。7I03-H株の分画方法の検討ボツリヌス菌において発現した各OrfXタンパク質の局在を解析するために分画を試みた。【mutanolysin（N-アセチルムラミダーゼ）を用いた分画】グラム陽性菌は細胞壁分解酵素mutanolysinによる処理と凍結破砕によって各画分を分離することができる（Proc Natl Acd Sci U S A. 2021, Mol Microbiol. 1999）。7I03-H株菌体をmutanolysinで処理しどの画分に各OrfXタンパク質が検出されるかを調べた。その結果、局在の結果が実験毎に異なり、分画時のmutanolysin処理条件では菌の著しい形態変化が観察された。このことから、mutanolysin処理条件が適切でないことが考えられた。【超遠心法を用いた分画】7I03-H株菌体をビーズ破砕したのち超遠心によって細胞膜画分及び細胞質画分に分離した。細胞膜局在のポジティブコントロールとして発現させた鞭毛モータータンパク質MotAタンパク質（Deme JC, et al., Nat Microbiol. 2020.）が膜画分にのみ検出されたことから、適切に分画されていることを確認した。