Structural Analysis of Nucleosomes by FRET System Using Fluorescent Nucleobases

使用荧光核碱基的 FRET 系统对核小体进行结构分析

基本信息

批准号：
20J23426
负责人：
平島眞吾
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、蛍光性核酸塩基からなるFRETペアを用いたヌクレオソームの構造分析である。一般的なFRETペアは測定対象となる生体分子の外側に飛び出しており、想定外の相互作用などが懸念される。一方、蛍光塩基はDNAのらせん構造に収まっており、元の構造への影響が小さい。さらに、蛍光塩基は水素結合などにより向きが固定されるため、FRET効率は距離に加えて配向にも依存する。本年度、申請者は主に(1)FRETペアを含むDNAの配列探索と(2)FRET効率の実験値と理論値が異なる原因の検討に取り組んだ。(1)前年度までは、ヌクレオソーム形成に必要な最小限の長さのDNA鎖を使用していた。当該年度においてはそれより長いDNA鎖や、FRETペアの位置が異なるDNA鎖を新たに合成し、ヌクレオソームにおけるFRET効率を測定した。しかし、いずれの場合もFRET効率の実験値の増加は見られず、前年度までの測定値と同様の値にとどまった。(2)実験値と理論値の違いについて考察を進めた。FRET効率が低下する主要な原因であるドナー分子の消光は見られなかった。屈折率もFRET効率に影響を与えるが、ドナーとアクセプター周辺の局所的な屈折率を測定することはできない。そこで、タンパク質と相互作用していないDNAを優先的に切断する酵素で再構成ヌクレオソームを処理したところ、DNAの切断が確認できた。これはヌクレオソームDNAの両端がヌクレオソームのコアから離れ、FRET効率の低下を引き起こしている可能性を間接的に支持する結果である。以上の研究成果をまとめた論文はChem. Eur. J.誌に掲載された。また、前年度に投稿していた含フッ素ヌクレオシドを導入したDNAの物性評価に関する論文はChemBioChem誌に掲載された。

这项研究的目的是使用由荧光核碱基组成的fRET对分析结构核小体。易于测量的生物分子之外的典型fret对弹出，并且担心意外相互作用。另一方面，荧光底座包含在DNA的螺旋结构中，对原始结构几乎没有影响。此外，由于荧光碱通过氢键固定在方向上，因此除了距离之外，FRET效率取决于方向。今年，申请人主要致力于（1）搜索包含FRET对的DNA序列，以及（2）研究FRET效率的实验和理论值不同的原因。（1）直到上一年，使用了核小体形成所需的最小长度的DNA链。在今年，新合成了具有不同位置的FRET对位置的较长的DNA链和DNA链，并测量了核小体的FRET效率。但是，无论哪种情况，均未观察到FRET效率的实验值的增加，并且该值保持与前一年的测量值相同。（2）我们讨论了实验值和理论值之间的差异。没有观察到供体分子的淬灭，这是降低FRET效率的主要原因。尽管折射率也影响了FRET效率，但不可能测量供体和受体周围的局部折射率。因此，当用一个优先切割与蛋白质相互作用的酶的酶处理重建的核小体时，DNA是裂解。这会导致间接支持核小体DNA的两端与核小体的核心分离，从而导致FRET效率降低。总结上述研究结果的论文发表在《化学杂志》杂志上。欧元。 J.此外，关于DNA的物理特性的论文引入了上一年发表的含氟核苷的论文，该论文发表在Chembiochem中。