デハイドリンが食品物性改良効果に及ぼす影響とその作用メカニズムの解明

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令和２～３年度に計画していた実験が、コロナ禍や世界情勢の影響で一部の試薬および機器の入手に手間取り、計画通りの遂行が不可能になったため、昨年度までに予定していた計画の一部を変更した。今年度は昨年度に引き続き、本研究の幅を広げる目的で当初の予定より組み換えパターンを増やした。特に、デハイドリンタンパク質のKセグメントと呼ばれる配列については、乳酸脱水素酵素の凍結変性防止に寄与している可能性が報告されており、本課題においても最も着目している配列である。そこで、①KセグメントをYYセグメントに置換、②KセグメントをYSセグメントに置換の２置換体の作製を試みた。これらの置換体は、置換部位が広範囲に渡るため、いずれも４つのステップに分けて段階的に置換を行った。いずれの置換体も、２ステップ目までの変異導入には成功した。しかし、３ステップ目のPCRによる変異導入後にアガロース電気泳動を行った結果、PCR産物が目的の塩基対数である5,500bpではなく8,000～9,000bpに確認されたため、PCRの条件検討、プライマーの再設計等、いくつかの改善策を試みたが成功には至らなかった。そこで、使用する酵素をこれまでのPrimeSTAR Mutagenesis Basal KitからPrimeSTAR GXLなど他の酵素に変更し3ステップ目の変異導入を試みている。一方で、これまでに変異導入に成功したものに関しては、タンパク質の発現誘導を行い、得られた部分置換デハイドリン組み換えタンパク質の機能性評価に着手した。