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Analysis of molecular mechanism of lysophospholipid transporters

溶血磷脂转运蛋白分子机制分析

基本信息

批准号：
20K06544
负责人：
西毅
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では血管内皮細胞のスフィンゴシン１リン酸（S1P）輸送体、SPNS2と赤血球および血小板のS1P輸送体、MFSD2BがそれぞれどのようにS1Pを輸送し受容体を活性化しているのかそのシグナル伝達の分子機構における普遍性と特異性を明らかにすることを目的としている。本年度もこれまでに引き続きS1P輸送体であるSPNS2のS1P輸送の分子機構を明らかにすることを目指し、部位特異的変異体の解析を進めた。また、MFSD2BのS1P輸送機構についてアミノ酸配列が60%同一で相同性の高いにも関わらずリゾポスファチジルコリン（LPC）輸送体として機能するMFSD2Aと比較することで、基質認識の特異性を検討し、輸送に同一の残基が関与するだけではなく、異なる領域の残基も関与していることを示す結果を得ることができた。これら異なる輸送体であるSPNS2、MFSD2BとMFSD2Aの機能残基の位置と高次構造での配置を他のMFS型輸送体の結晶構造を用いてモデリングすることで比較し、基質認識機構について明らかになりつつある。並行して、輸送体の高次構造を同定するためのタンパク質の大量発現系と精製法の検討を前年度に続き進めた。大腸菌を用いた発現系からは比較的大量なサンプルを得られたが、使用できる界面活性剤の種類に問題があり、これの改善を進めているが結晶化には至っていない。培養細胞を用いた発現系でも可溶化効率に問題があり、用いる界面活性剤や種々の条件検討を行うことで明らかに改善した結果を得ることができた。これを用いて結晶化に取り組んでいるが、今のところ結果は得られていない。

The aim of this study was to clarify the universality and specificity of S1P transporter, SPNS2, erythrocytes, platelet S1P transporter, MFSD2B transporter, receptor activation, and molecular mechanism of S1P transporter. This year, the molecular mechanism of SPNS2 and S1P transport has been clarified, and the site-specific variant has been analyzed. MFSD2B and S1P delivery mechanisms have 60% identity in acid alignment, high similarity in protein alignment (LPC), and functional comparison with MFSD2A. The results are shown in matrix recognition specificity, residue alignment in the same domain, and residue alignment in different domains. The positions and higher-order structures of functional residues of SPNS2, MFSD2B and MFSD2A in different transporters are compared with those of crystalline structures of MFS transporters. The high-order structure of the transport body is determined by the mass production system of the transport body and the purification method. The development of Escherichia coli in the use of a large number of different kinds of surfactants has been achieved, and the use of surfactants has been improved. Culture of cells in the middle of the development system to solve the problem, use the interface activity of the species to discuss the process, to improve the results The result of this crystallization is that it is impossible to obtain the crystal structure.