炭素－炭素結合形成に関わるラジカルＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン酵素の機能解析

参与碳-碳键形成的自由基S-腺苷-L-蛋氨酸酶的功能分析

基本信息

批准号：
19J11692
负责人：
佐藤秀亮
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ホパノイド生合成におけるユニークな炭素-炭素結合形成反応を触媒すると推定されるラジカルSAM酵素の基質を明らかにし、酵素反応を行って、酵素機能および反応機構を明らかにすることを目的としている。令和2年度は、主として、ホパノイドの側鎖の生合成初期段階の炭素鎖伸長反応を触媒するラジカルSAM酵素HpnHの機能解析を行った。筆者は前年度までの研究により、HpnHがジプロプテンを基質として認識し、ジプロプテンのC29位と5’-デオキシアデノシンのC5’位の間に新たな炭素-炭素結合を形成する反応を触媒し、(22R)-アデノシルホパンを生成することを明らかにした。HpnHが触媒する炭素-炭素結合形成反応の機構について次のように推定している。SAMの還元的開裂によって生じた5’-デオキシアデノシルラジカルがジプロプテンの末端に存在する二重結合にラジカル付加することで、炭素-炭素結合が形成される。このときC22位に生じたラジカルが立体選択的に水素化されることによって(22R)-アデノシルホパンが形成されると考えられる。重水中での反応解析において生成物のC22位に重水素が取り込まれたことから、ラジカル中間体の還元に水とのプロトン交換が可能なアミノ酸残基が関わると推察された。そこで今年度は、水素原子供与残基と考えられるHpnH中のシステインあるいはチロシンの点変異体を合計11種作成し、それらの酵素反応を検討した。その結果、システイン変異体において、収率の大幅な減少および立体選択性の消失が観測されたことから、HpnHが触媒する炭素-炭素結合形成反応の機構において、5’-デオキシアデノシルラジカルのジプロプテンへのラジカル付加反応によって生じたラジカル中間体がチオールから水素原子を立体選択的に引き抜くことによって、(22R)-アデノシルホパンが生成すると結論づけた。

这项研究旨在阐明自由基SAM酶的底物，这些酶被认为是为了催化植物生物合成中独特的碳碳键形成反应，并执行酶反应以阐明酶功能和反应机制。在2020财年中，主要针对自由基SAM酶HPNH进行了功能分析，该酶HPNH催化了霍甘类侧链生物合成的早期碳链延伸反应。直到上一年的研究表明，HPNH识别二吡替烯是底物，并催化反应，在二吡啶的C29位置和5'-脱氧腺苷的C5'位置之间形成新的碳碳键，产生（22R） - 丙烷基苯丙胺。 HPNH催化的碳碳键形成反应的机理估计如下。由SAM还原性切割产生的5'-脱氧腺苷自由基从根本上添加到存在二吡啶末端的双键中，从而形成了碳碳键。目前，在C22位置产生的自由基被立体选择性氢化，并且（22R） - 腺基苯丙烷被认为形成。在重水中的反应分析中，在反应分析中将氘掺入了产品的C22位置，并且估计能够与水与水交换的氨基酸残基参与减少自由基中间体。因此，今年，我们在HPNH中总共创建了11点突变体或酪氨酸的11点突变体，被认为是氢----型儿童抑制儿童残基，并检查了其酶反应。结果，在半胱氨酸突变体中观察到产量和立体选择性的丧失显着降低，得出的结论是，（22R） - 腺苷基磷酸是由从5'-脱氧二腺苷辐射的5'-脱氧腺苷辐射型二氢化基因构造的基本中的基于氢化剂的自由基中产生的自由基中间体产生的。 HPNH催化的碳碳键形成反应。