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環境応答性蛍光プローブを用いるタンパク質分解の可視化

使用环境响应荧光探针可视化蛋白质降解

基本信息

批准号：
19J12178
负责人：
高靖馳
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J12178/
关键词：
生細胞イメージング蛍光プローブタンパク質分解

项目摘要

タンパク分解は様々な生命機能を担う経路であり、その破綻はがんや神経変性疾患などにつながる。そのため、タンパク分解のリアルタイム追跡法は、生命科学研究だけでなく、創薬研究にも非常に有用である。研究代表者はこれまでに、PYPタグを用いる生細胞タンパク質ラベル化技術の開発に取り組み、PYPタグを可視化する蛍光プローブCG2を開発している。CG2は細胞内の水環境において蛍光を示さず、PYPタグと結合しその疎水性ポケットに入ることにより蛍光性となる。そこで、PYPタグが分解するとともにその疎水性ポケットが消失し、CG2は再び細胞内の水環境にさらされ非蛍光性となると考えられる。この蛍光の減少を、タンパク質の分解のリアルタイム可視化に応用することにした。CG2によるタンパク質分解の蛍光観察を確認するために、試験管においてCG2とPYPタグを反応させ、タンパク質分解酵素であるトリプシンを反応系中に添加した。その結果、CG2の蛍光の減少が見られ、CG2をタンパク質分解の蛍光観察に応用できることを試験管内で証明した。また、CG2とPYPタグが形成した複合体の安定性の向上に取り組み、CG2との相互作用を増やしたPYPタグの変異体PYPF96Dを開発した。PYPF96Dは生細胞において、CG2を用いる長時間にわたるタンパク質の観察を可能にした。最後に、PYPF96D変異体とCG2を、免疫応答を制御するRegnase-1の分解の生細胞イメージングに応用した。Regnase-1－PYPF96Dを発現する細胞にCG2を添加しラベル化を行った後、リポ多糖（LPS）を添加したところ、時間経過とともにCG2の蛍光の減少が観察された。一方、LPS刺激を受けない細胞では蛍光の減少が見られなかった。また、LPSに応答するRegnase-1－PYPF96Dの分解をウエスタンブロット法によりも確認できた。

タンパク decomposition は others 々な vital functions を bear う経 road であり, その flaw はがんや経 god - disorder などにつながる. そのため, タンパク decomposition のリアルタイムは tracing method, life sciences research だけでなく, gen 薬にも very useful にである. Research representatives はこれまでに, PYP タグを with いる living cells タンパク qualitative ラベル technology の open 発にみり group, PYP タグを visualization する蛍 light プローブ CG2 を open 発している. CG2 はの water environment in the cell において蛍 light を shown さず, PYP タグと combining しその疎 water-based ポケットに into ることにより蛍 optical となる. そこで, PYP タグが decomposition するとともにその疎 water-based ポケットが disappear し, CG2 はびの water environment in the cell again にさらされ non 蛍 light となると exam えられる. この蛍の reducing を, light タンパク qualitative の decomposition のリアルタイム visualization に応 with することにした. CG2 によるタンパク qualitative decomposition の蛍 light 観 examine を confirm するために, test tube において CG2 と PYP タグを anti 応させ, タンパク qualitative decomposition enzyme であるトリプシンを anti 応 of に add した. その results, CG2 の蛍の reduce が of light られ, CG2 をタンパク qualitative decomposition の蛍 light 観 examine に応 with できることを test tube で prove した. また, CG2 と PYP タグが form した complex の stability のに take up りみ, CG2 との interaction を raised やした PYP タグの - variant PYPF96D を open 発した. PYPF96D は living cells において, CG2 を with いる long にわたるタンパク qualitative の観 examine を may にした. Final に, PYPF96D - variant と CG2 を, immune 応 answer を suppression するの decomposition の Regnase - 1 living cells イメージングに応 with した. Regnase - 1 - PYPF96D を発 now する cells に CG2 を add しラベル change line をった, リポ polysaccharide (LPS) を add したところ, time 経とともに CG2 の蛍 light の reduce が観 examine された. One side, lPS-stimulated を received けなった cells で蛍蛍 light <s:1> reduced が see られな蛍った. また, LPS に応 answer する Regnase - 1 - PYPF96D の decomposition をウエスタンブロット method によりも confirm できた.