Structural and functional analysis of the active state of the prostaglandin receptor

前列腺素受体活性状态的结构和功能分析

• 批准号: 19J12880
• 负责人: 野島 慎五
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J12880/
• 关键词: 膜タンパク質; GPCR; プロスタグランジン; クライオ電子顕微鏡; 構造解析; X線結晶構造解析

今年度は昨年度にクライオ電子顕微鏡で撮影したEP4-miniGsβγ-Gs抗体の複合体の電子顕微鏡像を元に、単粒子解析法による構造解析を行い、分解能3.3オングストロームの３次元電子顕微鏡像を取得することに成功した。また、取得した電子顕微鏡像を元に原子座標モデルを構築することにも成功した。得られた構造からEP4は、同じPGE2受容体であるEP3と同様のPGE2の結合様式をしていたが、リガンドポケットの最奥部にEP3にはない空間がEP4に存在することが判明した。また不活性型EP4に存在する、リガンドの侵入経路と思われる溝が活性型EP4では閉じていることが確認された。さらにEP4の細胞内側での膜貫通ヘリックス6（TM6）の開き具合は、他のGPCR-Gs複合体よりも小さいという特徴があった。この特徴のため、これまで解明されたGPCR-Gs複合体の構造では存在しなかった、TM2とGsのC末端との結合が確認された。これらの構造情報を元に、EP4のリガンドポケット部分およびGタンパク質結合部分のアミノ酸残基の変異体のプラスミドを作成し、HEK細胞で発現させた。このHEK細胞を利用し、cAMP依存的なルシフェラーゼを使用したレポーターアッセイによって、各残基の変異がGsシグナルの活性に及ぼす影響を調べた。その結果、リガンドポケット部分ではEP3で活性化に重要と考えられている残基に相当する残基がEP4でも活性に関与していることが明らかになった。またGタンパク質結合部分では、PG受容体に保存されているTM2のフェニルアラニン（Phe54）がEP4によるGsの活性化に重要であることが判明した。これらの知見は活性機構に基づいたEP4作動薬の開発への応用が期待される。そして以上の結果をまとめた論文を米国科学誌『Structure』に投稿し、12月１日にオンライン上で掲載された。

This year’s and last year’s electronic micromirror imaging of EP4-miniGsβγ-Gs antibody complex were performed. The single particle analysis method has been successfully used to achieve structural analysis and decomposition energy of 3.3 オングストロームの３dimensional electron micromirror.また、Acquired the したelectronic micromirror を元にatomic coordinates モデルをconstructed the することにもsuccessfully. The structure of the structure is EP4, the PGE2 acceptor is EP3, and the combination of PGE2 and PGE2 is the same.ていたが, リガンドポケットのmostokube にEP3 にはないspace がEP4に existence することが clarified した.またInactive type EP4 exists する, リガンドのinvasive 経路と思われるchannel がActive type EP4 では closes じていることがconfirm された.さらにEP4のCell Intracellular Membrane Penetrating ヘリックス6 (TM6) の开き合は, のGPCR-Gs Complex よりも小さいという特徴があった.この特徴のため、これまでElucidation of the structure of the GPCR-Gs complex and its existence しなかった、TM2 and GsのC terminus and とのbinding confirmation された.これらのstructural information を元に、EP4のリガンドポケットPart およびGタンパクquality knot It is made by combining part of the のアミノ acid residues and the allogeneic のプラスミドを, and the HEK cells are now させた. The use of HEK cells and the use of cAMP-dependent DNAーアッセイによって, each residue's の変different がGsシグナルのactive に and ぼす influence the をadjusted べた.そのRESULTS, リガンドポケット PART ではEP3 ACTIVATION に IMPORTANT ANALYSIS えられているThe residues are equivalent to the residues EP4 and the active residues are the same as the residues.またGタンパクPlasmic binding part では, PG acceptor にSave されているTM2 のフェニルアThe importance of activation of EP4 and Gs of Phe54 is clearly understood. The active mechanism of これらの知は にbased づいたEP4 activating 薬の开発への応用が出される. The above results were submitted to the American Journal of Science "Structure" and published on December 1st.