クライオ蛍光顕微鏡による生体分子の分子精度イメージング

使用冷冻荧光显微镜对生物分子进行分子精密成像

• 批准号: 19J13557
• 负责人: 古林 琢
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J13557/
• 关键词: 超解像蛍光顕微鏡; 分子確度イメージング

本研究の目標である生体分子の分子レベルイメージングに向けて、クライオ蛍光顕微鏡を用いて微小管の構造を分子レベルで光イメージングすることを目指した。本実験の前提となるクライオ蛍光顕微鏡による分子確度イメージングについて、論文化し発表をした。The Journal of Physical Chemistry Letters誌に2019年9月に発表された。この内容の実験に反映させるべく、微小管を構成するタンパク質であるチューブリンに蛍光色素の染色を行った。これにより微小管の分子レベルイメージングを行うことを計画していた。クライオ温度に凍結して微小管をイメージングできることを確認したが、分子レベルイメージングには至らなかった。原因は、①１分子ごとに位置決定をする際、他の蛍光分子が背景光ノイズ、②１分子ごとに励起するはずの色素が機能していないことが挙げられる。①について、私が開発したクライオ蛍光顕微鏡には背景光ノイズに弱いという弱点がある。これを克服する顕微鏡の開発を行っていた。この改良に向け、光学シミュレーションソフトを用いた。現在、この新しいクライオ蛍光顕微鏡の性能の評価を行っている。②について、微小管のようなタンパク質の集合体を１分子ごとに観察するには、光学顕微鏡の分解能を超える必要がある。我々は、クライオ温度に冷やした分子を、励起光を選択することで１つずつ位置決定を行い、分子レベルイメージングを行うことを目指している。クライオ温度に冷えた蛍光色素は、１分子ごとの周りの環境に応じて吸収スペクトルが細くなり異なるスペクトルとなる。これを用いて微小管の分子レベルイメージングを行った。しかし、選択した色素の吸収スペクトルが思うように細いものにならず、１分子ごとのイメージングが出来なかった。そこで、使用する色素の検討を行ったが、現状、相応しいものを見つけられていない。

This study の target で あ る raw body の molecules レ ベ ル イ メ ー ジ ン グ に to け て, ク ラ イ オ 蛍 light 顕 micromirror を with い て tiny tube の を molecules レ ベ ル で light イ メ ー ジ ン グ す る こ と を refers し た. This be 験 の premise と な る ク ラ イ オ 蛍 light 顕 micromirror に よ る molecular accuracy of イ メ ー ジ ン グ に つ い て, theory of culture し 発 table を し た. The Journal of Physical Chemistry Letters に September 2019 に published された. こ の content の be 験 に reflect さ せ る べ く, tiny tube を す る タ ン パ ク qualitative で あ る チ ュ ー ブ リ ン に 蛍 light line pigment dyeing を の っ た. こ れ に よ り tiny tube の molecular レ ベ ル イ メ ー ジ ン グ を line う こ と を project し て い た. ク ラ イ オ freezing temperature に し て tiny tube を イ メ ー ジ ン グ で き る こ と を confirm し た が, molecular レ ベ ル イ メ ー ジ ン グ に は to ら な か っ た. Reason は, 1 (1) molecular ご と に location decision を す る interstate, he の 蛍 が background light light molecules ノ イ ズ, 1 (2) the molecular ご と に wound up す る は ず の pigment が function し て い な い こ と が 挙 げ ら れ る. 1) に つ い て, private が 発 し た ク ラ イ オ 蛍 light 顕 micromirror に は background light ノ イ ズ に weak い と い う weakness が あ る. Youdaoplaceholder2 れを overcomes する顕 micro-mirror lens development を line って た た. <s:1> <s:1> is improved by に to け and optics by シ シ ュレ ショ ショ ソフトを ソフトを. Now, the performance evaluation of the <s:1> performance <e:1> of the new <s:1> <s:1> <s:1> <s:1> ラ 蛍 蛍 optical 顕 micromirror 価を is 価を and って る る る. (2) に つ い て, tiny tubes の よ う な タ ン パ ク qualitative の 1 molecular aggregation を ご と に 観 examine す る に は, optical 顕 micromirror の can decompose を super え る necessary が あ る. I 々 は, ク ラ イ オ cold temperature に や し た molecular を, excitation light を sentaku す る こ と で 1 つ ず を つ position row い, molecular レ ベ ル イ メ ー ジ ン グ を line う こ と を refers し て い る. ク ラ イ オ cold temperature に え た 蛍 photopigment は, 1 molecular ご と の weeks り の environment に 応 じ て suction 収 ス ペ ク ト ル が fine く な り different な る ス ペ ク ト ル と な る. Youdaoplaceholder6 れを uses a れを て microtube, a <s:1> molecule レベ, メ, メ, ジ, グを, グを lines った. し か し, sentaku し た pigment の suction 収 ス ペ ク ト ル が think う よ う に fine い も の に な ら ず, 1 molecular ご と の イ メ ー ジ ン グ が out な か っ た. そ こ で, use す る pigment の 検 line for を っ た が, the present situation, the phase 応 し い も の を see つ け ら れ て い な い.

项目成果

クライオ蛍光顕微鏡による分子確度イメージングの実現

使用冷冻荧光显微镜实现分子精确成像

• 发表时间: 2019
• 作者: 古林 琢;中田栄司;森井孝;藤芳暁;松下道雄
• 通讯作者: 松下道雄

Aberration-corrected cryogenic objective mirror with a 0.93 numerical aperture

• DOI: 10.1063/1.5110546
• 发表时间: 2019-07
• 期刊: Applied Physics Letters
• 影响因子: 4
• 作者: M. Fujiwara;T. Ishii;Keita Ishida;Y. Toratani;Taku Furubayashi;M. Matsushita;S. Fujiyoshi

Nanometer Accuracy in Cryogenic Far-Field Localization Microscopy of Individual Molecules

单个分子低温远场定位显微镜的纳米精度

• DOI: 10.1021/acs.jpclett.9b02184
• 发表时间: 2019
• 期刊: The Journal of Physical Chemistry Letters
• 作者: Furubayashi Taku;Ishida Keita;Kashida Hiromu;Nakata Eiji;Morii Takashi;Matsushita Michio;Fujiyoshi Satoru
• 通讯作者: Fujiyoshi Satoru