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ｐｉＲＮＡ生合成におけるＰａｐｉリン酸化修飾の生物学的意義の解明

阐明 Papi 磷酸化修饰在 piRNA 生物发生中的生物学意义

基本信息

批准号：
19J13939
负责人：
山田紘実
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J13939/
关键词：
piRNA Papi リン酸化 RNA結合タンパク質ミトコンドリア BmN4細胞

项目摘要

生殖組織で高発現する小分子ノンコーディングRNAのpiRNAは、PIWIタンパク質と複合体を形成し、相補的な配列を持つトランスポゾンの転移を抑制することで、ゲノムを安定的に維持している。カイコ卵巣由来生殖細胞株BmN4では、ミトコンドリア局在型タンパク質PapiがpiRNA成熟化の足場として機能することで、piRNAの生成を促進していると考えられている。これまでの当研究室の解析により、Papiのリン酸化修飾とPapiのRNA結合との間に関連が示唆されていたが、その詳細なメカニズムやpiRNA生合成におけるリン酸化修飾の生物学的意義は不明であった。本研究ではまず、質量分析によりPapiのリン酸化修飾残基を複数同定した。同定されたリン酸化修飾残基の非リン酸化変異体を用いた解析により、1つのセリン残基のリン酸化修飾が、PapiのRNA結合能さらにはpiRNA生合成に必要であることが明らかとなった。また、in vitroリン酸化アッセイ系の確立により精製が可能となったPapiを標的としたリン酸化酵素を含むタンパク質群をショットガン質量分析することで、リン酸化酵素の候補因子群が得られた。これらの候補因子に対し、piRNA生合成量及びPapiのリン酸化レベルを指標とした遺伝子ノックダウン(KD)スクリーニングを行った結果、先に同定したPapiのRNA結合能及びpiRNA生合成に重要なリン酸化を担う修飾酵素の同定に成功した。リン酸化修飾酵素の相互作用因子の解析や、カイコPIWIタンパク質Siwiを欠失した条件での解析により、BmN4細胞におけるpiRNA生合成には、PapiとSiwiの相互作用と、Papiのリン酸化修飾の両方が必要であることが明らかとなった。今後は、擬似リン酸化変異体を用いた解析を行うことで、piRNA生合成におけるPapiリン酸化修飾の意義を明らかにする。

In reproductive tissues, small molecules are highly expressed, and piRNA, PIWI, and protein complexes are formed, complementary alignment is maintained, and migration is inhibited. The egg is derived from the germ cell line BmN4 and is currently in the process of piRNA maturation. The relationship between Papi's RNA binding and Papi's RNA binding was demonstrated in the present study. The biological significance of Papi's RNA binding was unknown. In this study, we determined the identity of multiple residues in Papi by mass spectrometry. The RNA binding energy of Papi is necessary for the synthesis of piRNA. In vitro acidification system establishment, purification, identification, quality analysis, candidate factor group for acidification enzyme The candidate factors for piRNA synthesis and Papi RNA synthesis were determined by the identification of Papi RNA binding energy and Papi RNA modification enzymes. Analysis of the interaction factors of the acidification modification enzymes, the analysis of the interaction factors of the acidification modification enzymes, the interaction factors of the acidification modification enzymes, the interaction factors, the interaction In the future, the significance of the modification of RNA synthesis will be clarified.