ｐｉＲＮＡ生合成におけるＰａｐｉリン酸化修飾の生物学的意義の解明

生殖組織で高発現する小分子ノンコーディングRNAのpiRNAは、PIWIタンパク質と複合体を形成し、相補的な配列を持つトランスポゾンの転移を抑制することで、ゲノムを安定的に維持している。カイコ卵巣由来生殖細胞株BmN4では、ミトコンドリア局在型タンパク質PapiがpiRNA成熟化の足場として機能することで、piRNAの生成を促進していると考えられている。これまでの当研究室の解析により、Papiのリン酸化修飾とPapiのRNA結合との間に関連が示唆されていたが、その詳細なメカニズムやpiRNA生合成におけるリン酸化修飾の生物学的意義は不明であった。本研究ではまず、質量分析によりPapiのリン酸化修飾残基を複数同定した。同定されたリン酸化修飾残基の非リン酸化変異体を用いた解析により、1つのセリン残基のリン酸化修飾が、PapiのRNA結合能さらにはpiRNA生合成に必要であることが明らかとなった。また、in vitroリン酸化アッセイ系の確立により精製が可能となったPapiを標的としたリン酸化酵素を含むタンパク質群をショットガン質量分析することで、リン酸化酵素の候補因子群が得られた。これらの候補因子に対し、piRNA生合成量及びPapiのリン酸化レベルを指標とした遺伝子ノックダウン(KD)スクリーニングを行った結果、先に同定したPapiのRNA結合能及びpiRNA生合成に重要なリン酸化を担う修飾酵素の同定に成功した。リン酸化修飾酵素の相互作用因子の解析や、カイコPIWIタンパク質Siwiを欠失した条件での解析により、BmN4細胞におけるpiRNA生合成には、PapiとSiwiの相互作用と、Papiのリン酸化修飾の両方が必要であることが明らかとなった。今後は、擬似リン酸化変異体を用いた解析を行うことで、piRNA生合成におけるPapiリン酸化修飾の意義を明らかにする。

生殖組織で高発現する小分子ノンコーディングRNAのpiRNAは、PIWIタンパク質と複合体を形成し、相補的な配列を持つトランスポゾンの転移を抑制することで、ゲノムを安定的に維持している。カイコ卵巣由来生殖細胞株BmN4では、ミトコンドリア局在型タンパク質PapiがpiRNA成熟化の足場として機能することで、piRNAの生成を促進していると考えられている。これまでの当研究室の解析により、Papiのリン酸化修飾とPapiのRNA結合との間に関連が示唆されていたが、その詳細なメカニズムやpiRNA生合成におけるリン酸化修飾の生物学的意義は不明であった。本研究ではまず、質量分析によりPapiのリン酸化修飾残基を複数同定した。同定されたリン酸化修飾残基の非リン酸化変異体を用いた解析により、1つのセリン残基のリン酸化修飾が、PapiのRNA結合能さらにはpiRNA生合成に必要であることが明らかとなった。また、in vitroリン酸化アッセイ系の確立により精製が可能となったPapiを標的としたリン酸化酵素を含むタンパク質群をショットガン質量分析することで、リン酸化酵素の候補因子群が得られた。これらの候補因子に対し、piRNA生合成量及びPapiのリン酸化レベルを指標とした遺伝子ノックダウン(KD)スクリーニングを行った結果、先に同定したPapiのRNA結合能及びpiRNA生合成に重要なリン酸化を担う修飾酵素の同定に成功した。リン酸化修飾酵素の相互作用因子の解析や、カイコPIWIタンパク質Siwiを欠失した条件での解析により、BmN4細胞におけるpiRNA生合成には、PapiとSiwiの相互作用と、Papiのリン酸化修飾の両方が必要であることが明らかとなった。今後は、擬似リン酸化変異体を用いた解析を行うことで、piRNA生合成におけるPapiリン酸化修飾の意義を明らかにする。