Development of a methane-oxidizing biocatalyst that functions in a heterologous host using a single-cell methanol sensor

(1)一細胞酵素活性可視化宿主『メタノールセンサー酵母』を用いて高活性MOB遺伝子を精度よく選抜するため、グルコースを含む培地からメタノールを含む培地に細胞を移した際にメタノール誘導性遺伝子が受ける「グルコース抑制」「脱抑制」「メタノール誘導」について、本センサー酵母を用いて詳しく解析した。その結果、脱抑制はグルコースが急激に枯渇すると見られないのに対し、グルコースが徐々に枯渇すると顕著に見られることを明らかにした。本知見は高活性MOB選抜のための培養条件の最適化に有用であるとともに、本酵母のメタノール誘導性遺伝子発現制御を理解する基盤としても重要と考えられる。(2)MOBプロトタイプについて、アミノ酸配列の変異による高活性化を試みたところ、pmoAサブユニット由来断片への変異の導入により、活性が著しく向上、もしくは見られなくなることがわかった。本知見は、触媒部位の構造形成におけるpmoAサブユニット由来断片の寄与を新たな形で示唆するものであり、銅を含む活性中心を主として議論されてきたメタン酸化の触媒機序にも新しい展開をもたらすと考えられる。活性が向上した変異体については目的のメタン酸化生体触媒の候補と位置づけており、現在、精製タンパク質を用いた活性評価、および本変異体発現細胞によるメタンのバイオマスへの取り込みなどについて、さらなる検討を加えている。また、自然界由来の遺伝子断片の増幅と連結による遺伝子ライブラリも追加で作製し、現在、メタノールセンサー酵母を用いて高活性タンパク質遺伝子の選抜を試みている。(3)天然資源からのメタノール生成反応のさらなる一例として、細菌によるメタノールのバイオマスへの固定反応の大腸菌内での逆行を試み、菌体反応によりグルコースやF6Pからメタノールが生産されることを見出し、自然界で知られていないメタノール生成経路の構築と実証に成功した。

(1)一細胞酵素活性可視化宿主『メタノールセンサー酵母』を用いて高活性MOB遺伝子を精度よく選抜するため、グルコースを含む培地からメタノールを含む培地に細胞を移した際にメタノール誘導性遺伝子が受ける「グルコース抑制」「脱抑制」「メタノール誘導」について、本センサー酵母を用いて詳しく解析した。その結果、脱抑制はグルコースが急激に枯渇すると見られないのに対し、グルコースが徐々に枯渇すると顕著に見られることを明らかにした。本知見は高活性MOB選抜のための培養条件の最適化に有用であるとともに、本酵母のメタノール誘導性遺伝子発現制御を理解する基盤としても重要と考えられる。(2)MOBプロトタイプについて、アミノ酸配列の変異による高活性化を試みたところ、pmoAサブユニット由来断片への変異の導入により、活性が著しく向上、もしくは見られなくなることがわかった。本知見は、触媒部位の構造形成におけるpmoAサブユニット由来断片の寄与を新たな形で示唆するものであり、銅を含む活性中心を主として議論されてきたメタン酸化の触媒機序にも新しい展開をもたらすと考えられる。活性が向上した変異体については目的のメタン酸化生体触媒の候補と位置づけており、現在、精製タンパク質を用いた活性評価、および本変異体発現細胞によるメタンのバイオマスへの取り込みなどについて、さらなる検討を加えている。また、自然界由来の遺伝子断片の増幅と連結による遺伝子ライブラリも追加で作製し、現在、メタノールセンサー酵母を用いて高活性タンパク質遺伝子の選抜を試みている。(3)天然資源からのメタノール生成反応のさらなる一例として、細菌によるメタノールのバイオマスへの固定反応の大腸菌内での逆行を試み、菌体反応によりグルコースやF6Pからメタノールが生産されることを見出し、自然界で知られていないメタノール生成経路の構築と実証に成功した。