多階層イメージングを可能にする新規蛍光プローブ群の開発

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神経細胞のつながりであるシナプスを経時的に同一個体で観察することが出来れば、学習や記憶、そして疾患発症の前後における神経回路改変を捉える“機能的”コネクトミクスが達成出来ると考えられた。そのため、新生・増大した樹状突起スパインを標識し、光操作することが可能な新規光プローブAS-PaRac1(Activated Synapse Targeting Photoactivatable Rac1)の性質を最大限利用し、学習に伴って増強するシナプス群であるシナプス・アンサンブルを大規模に可視化する技術を確立することを目指している。そして本プロジェクトの最大の障壁の一つが、シナプス前部をmTurquoise2 fused VAMP2、シナプス前部が投射する神経細胞をtdTomato、そしてシナプス後部（スパイン）をAS-PaRac1-mCloverの3色で多重標識した際に観察される3重標識punctaにおいて、シナプスが形成されているかどうか検証することである。これらのプローブを前頭前野と扁桃体にウイルスベクターで導入した場合、十分な数の3重標識punctaを得るために要するマウス数は非常に多くなることが予想された。そのため、この検証を効率的に進めるため、マウスSlice cultureに直接アデノ随伴ウイルスベクター (AAV)を感染させ、3重標識punctaをSlice culture上で観察することを計画し、実験条件の最適化を行った。その結果、Slice cultureに作製済みのAAVでプローブを発現させることに成功し、現在3重標識像におけるシナプス観察を行っている。シナプスの有無を判定するための方法として、3重標識像を有するpunctaをSucroseで刺激し、誘発されたシナプス前部からのvesicle releaseをPost neuronからのWhole-cell patch clamp recordingで検出することを計画している。