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解離システムを組み込んだ細胞内機能性ペプチド探索系の構築とその応用

结合解离系统的细胞内功能肽检测系统的构建及其应用

基本信息

批准号：
19J15519
负责人：
小崎一功
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J15519/
关键词：
ペプチドスクリーニング細胞内環境

项目摘要

本研究では、所属研究室で開発された「細胞内機能性ペプチド探索系」の問題点の1つである「細胞透過性ペプチド(CPP)付加による機能性ペプチド活性への影響」を除くことを目的とし、研究を行った。本研究は細胞内で機能を発揮するペプチドを効率よく機能評価、改良することが可能な技術となり、ペプチドを元にした医薬品開発やペプチドの機能同定などに応用可能な技術である。本研究では、CPPと機能性ペプチドを効率よくジスルフィド架橋可能な合成手法を考案した。分岐鎖ペプチド合成技術とペプチドアレイを組み合わせた新規合成法を開発した。具体的には、ヘテロ分岐鎖合成法により、主鎖側にCPP-Cys-光切断リンカーを合成、側鎖側に機能性ペプチド-Cys-光切断リンカーを合成し、一つの分子内に2種類のペプチドを合成、分子内でジスルフィド形成を行うというものである。本手法により、従来法である溶液中での酸化による異種ペプチド間のジスルフィド形成の課題であった夾雑物の形成(ホモ二量体形成）を抑制することが可能になった。質量分析により、目的のヘテロ二量体が選択的に合成されていることが確認できた。さらに、細胞内の還元条件でジスルフィド結合が分解し、目的のCPPと機能性ペプチドの細胞内解離が起こることが示唆された。細胞死を誘導するペプチド(WELVVLGKL)を用いて、ペプチドの機能評価が可能か、ペプチドの探索が可能か検証した。CPP-細胞死誘導ペプチドのヘテロ二量体ペプチドは高い細胞死活性を示し、構築したシステムを用いてペプチドの細胞内活性評価が可能であることを確認した。さらに、1アミノ酸置換ペプチド152種の細胞死活性評価を行い、元ペプチドと比較して高い活性を示すペプチドを同定した。本実験により、CPPの影響を排除した細胞内で機能するペプチドの探索系の構築に成功し、機能性ペプチド本来の細胞内活性を評価可能になった。

This study was carried out in response to the question of "the effect of cell permeability selection (CPP) on functional selection activity" developed by our laboratory. This study focuses on the development of intracellular functions, functional evaluation, improvement, and possible technologies for the development of medical products. In this study, CPP and functional bridging techniques were investigated. A new method of synthesis was developed for the separation of materials. Specifically, the main lock side CPP-Cys-photocutoff synthesis method, the side lock side functional selection-Cys-photocutoff synthesis method, the intramolecular synthesis method, the intramolecular synthesis method, and the intramolecular formation method are described. This method is used to inhibit the formation of inclusions in the acidified solution. Quality analysis, objective and quantitative synthesis of selected substances In addition, the intracellular conditions for the reduction of CPP binding and decomposition, the purpose of CPP functional selection and intracellular dissociation of the initiation of this process. Cell death induction is possible by selecting the site (WELVLGKL), evaluating the site's functionality, and exploring the site's functionality. CPP-induced cell death was identified by the use of two quantitative methods to evaluate the intracellular activity of CPP-induced cells. In addition, 152 kinds of cell viability were evaluated by acid substitution, and the activity of cell selection was determined by comparison. This study was conducted to evaluate the effects of CPP on the intracellular activity of the cells.