tRNA安定化に寄与するリン酸化修飾を触媒する新規酵素ARKIの分子機構の解明

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最終年度はまずtRNA結晶構造の詳細な観察を行った。一つの結晶からMol. A、Bの2つの構造が観察され、Mol. BではtRNAコア構造の変化が観察された。Mol. Bでは標準的なベーストリプルを構成するG46が上方に離脱しUp47とスタックし、その代わりに下方のC9がせり上がり、新たなベーストリプルを形成していた。その際Up47周辺の結合角変化はG46やC9と比べ小さく、Up47はtRNAの熱変性において解離してきたG46を受け止め、主鎖の回転を防ぐことで準安定なMol. Bを安定化し熱変性を防ぐと考えられた。tRNAの柔軟性を結晶構造から示した事は従来の常識を覆す成果である。次に、ArkIについて反応速度論解析を行った。その結果、ATPに対するKm値は約1.3 mMと非常に大きく、親和性が低かった。この事からArkIによるUp修飾形成が細胞内ATP濃度にセンシティブであることが示唆された。次に、Up修飾の可逆性について、IkrAの生体内での活性を観察した。大腸菌内でarkIを定常発現させ、ikrAをIPTG誘導性プロモーター下に導入した。その結果Up修飾を含む断片はIPTG依存的に減少し、IkrAが生体内でeraserとして機能しうる事が示された。これはタンパク質におけるリン酸化のようなエピトランスクリプトミックな遺伝子発現制御系がtRNAにも存在する可能性を示唆している。以上の成果を「Nature」誌に投稿し受理された。最後に、アーキア細胞内でUp修飾の代謝回転を観察する系を構築した。酸素18（18O）で標識した水を含む培地での前培養によりUp修飾を18O標識し、通常の培地に移し替え培養することでUp修飾の代謝回転速度を観察した。培養開始から4時間までのtRNAについてLC/MS解析を行ったところ、実際に18Oが通常の16Oに置き換わっていく様子が観察できた。