オピオイド受容体-βアレスチン2経路を介するシグナル伝達機構の解明

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申請者は前年度までに、μオピオイド受容体-βアレスチン経路の活性化には、βアレスチンとクラスリン重鎖(CHC)との会合が重要であることを見出した。βアレスチン経路は、オピオイドによって誘発される呼吸抑制や消化管運動障害などの副作用の発現に関与すると想定されている。申請者はこれまで、神経芽細胞腫・SH-SY5Y細胞を利用し、MAPK経路をβアレスチン経路として評価してきた。しかし、先行研究において、MAPK経路がオピオイドの副作用発現に直接的に関与するかは示されていない。そこで、今年度はC57BL/6Jマウスを利用し、生体において同経路を阻害することでオピオイドによる呼吸抑制が軽減されるかを評価した。Whole body plethysmographyを作成し、非侵襲的に呼吸数をモニタリングした。まず、先行研究を参考に、オピオイドの投与量と投与経路を決定し、呼吸抑制の程度を評価した。次に、βアレスチンとCHCとの結合を阻害するPitstop2がオピオイドによる呼吸抑制を軽減するかを評価する実験を計画した。Pitstop2は脂溶性が高く、水に難溶性でDMSOに溶解して用いる。しかし、細胞実験と等価量をマウスに投与すると、過量のDMSOによる急性毒性のため、呼吸抑制を正確に評価できないという問題に直面した。複数の溶媒を試し、最終的にcorn oilを使用したが、超音波破砕処理をしても十分には溶解しなかった。生体内で薬剤が徐放される可能性も考え、Pitstop2投与群と非投与群とで比較実験を進め、Pitstop2が中枢神経に移行したか評価することにした。オピオイドやPitstop2投与後に、マウス延髄でのMAPK活性化の評価を試みたが、ウェスタンブロッティング法やqPCR法でもMAPKの活性化の評価ができなかった。このため、Pitstop2が作用しているかどうか客観的に評価できず、本研究計画期間内に動物実験まで遂行するのは困難だと判断した。前年度までに得られた知見を論文化して投稿し、現在リバイス実験中である。