小胞体ーゴルジ体を経由しないガレクチン新規分泌経路の解明

阐明不通过内质网和高尔基体的新半乳糖凝集素分泌途径

• 批准号: 19J40312
• 负责人: 山口 亜利沙
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: Kochi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-10-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J40312/
• 关键词: ガレクチン; 非古典的分泌経路; EMARS; プロテオミクス; 分子会合; 非古典的経路分泌

独自に開発した第２世代EMARS法を用いて、積年の謎であるガレクチンの細胞外分泌機構の解明に挑んだ。ガレクチン３の分泌に寄与する分子を見つけるために、ガレクチン３の分泌を制御する薬剤の探索、ガレクチンとEMARS反応触媒酵素のキメラタンパク質の発現、ガレクチン３と会合する分子の同定を計画し、研究を進めた。昨年まで、ガレクチン３変異体（R186S）は分泌が抑制されることや、コレステロール輸送体阻害剤U18666A処理によりガレクチン３濃縮小胞が形成され分泌が促進されることを見出した。これら分泌速度の異なる諸条件について、発現mCherry-APEX-ガレクチン３を用いたEMARS反応を行い、SILAC法によるサブトラクション解析を行った。その結果、mCherry-APEX-ガレクチン３の近傍に存在する分子として、アクチン結合関連分子(αactinin-4,Caplin-1,Transgelin-2, cortactin, FilaminA,Profilin-1） が多数検出された。さらに、アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンにより、ガレクチン３の分泌が抑制された。また、ガレクチン３の分泌が促進されるU18666Aを添加した条件においてもSILAC法による質量分析を行った。その結果、mCherry-APEX-ガレクチン３の近傍に存在する分子として、Rab5が同定された。Rab5を免疫染色し、共焦点顕微鏡にて観察したところ、U18666A添加時に形成される濃縮小胞と一致した。これらのことから、アクチン結合関連分子およびRab5がガレクチン3の分泌に関与している可能性が示唆された。なお、mCherry-APEX-ガレクチン３の近傍に存在する分子として内在的に発現するガレクチン３自体が検出されたので、EMARS法の実験系はうまく機能していると思われた。

The 2nd generation EMARS method was developed independently and used to elucidate the extracellular secretion mechanism of the cell. The discovery of the secretion and regulation of the secretion of the enzyme of EMARS, the development of the secretion and regulation of the secretion and regulation of the secretion of EMARS, the development of the secretion and regulation of the secretion and regulation of the molecule of EMARS, and the progress of the research. In the past year, the secretion of R186S was inhibited by U1866A treatment, and the secretion was promoted by U1866A treatment. The condition of secretion rate difference was analyzed by EMARS and SILAC method. As a result, mCherry-APEX-1,Caplin-1,Transgelin-2, Cortactin, FilaminA and Profilin-1 were detected in most cases. In addition, the secretion of anti-tumor drugs can be inhibited by anti-tumor drugs. U1866A was added to the SILAC method for quality analysis. As a result, mCherry-APEX-3 and Rab5 are identical. Rab5 immunostaining, confocal microscopy, U1866A addition, formation of concentrated cells The possibility of the secretion of Rab5 and Rab 3 is also discussed. In addition, mCherry-APEX-EMARS method has the function of detecting the presence of molecules in the vicinity of EMARS method and detecting the presence of molecules in the vicinity of EMARS method.

项目成果

The Enzyme-Mediated Activation of Radical Sources (EMARS) Reaction: A New Tool for Identification of Membrane Microdomain-Associated GPI-Anchored Glycoprotein Partners

酶介导的自由基源激活 (EMARS) 反应：鉴定膜微结构域相关 GPI 锚定糖蛋白伴侣的新工具

• DOI: 10.1016/b978-0-12-819475-1.00028-6
• 发表时间: 2021
• 期刊: Comprehensive Glycoscience: Second Edition
• 作者: Kotani Norihiro;Miyagawa-Yamaguchi Arisa;Honke Koichi
• 通讯作者: Honke Koichi

高知大学医学部生化学講座

高知大学医学部生物化学系

Proximity Labeling and Proteomics: Get to Know Neighbors

邻近标记和蛋白质组学：了解邻居

• DOI: 10.1016/bs.mie.2022.07.031
• 发表时间: 2023
• 期刊: Methods in Enzymology
• 作者: Kotani Norihiro;Araki Tomoyuki;Miyagawa-Yamaguchi Arisa;Amimoto Tomoko;Nakano Miyako;Honke Koichi
• 通讯作者: Honke Koichi

The EMARS Reaction for Proximity Labeling

近距离标签的 EMARS 反应

• DOI: 10.1007/978-1-4939-9537-0_1
• 发表时间: 2019
• 期刊: Methods in Molecular Biology
• 作者: Honke Koichi;Miyagawa-Yamaguchi Arisa;Kotani Norihiro
• 通讯作者: Kotani Norihiro