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細胞質における機能性RNA生成機構の解明とRNAベクター技術への応用

细胞质中功能性RNA产生机制的阐明及其在RNA载体技术中的应用

基本信息

批准号：
19K06501
负责人：
佐野将之
金额：
$ 2.75万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K06501/
关键词：
miRNA 細胞質RNAベクター人工miRNA RNAi microRNA RNAベクター

项目摘要

センダイウイルスはネガティブ一本鎖RNAをゲノムに持つウイルスであり、宿主の細胞質において、ウイルスゲノムの複製及びウイルスmRNAの転写を行う。我々は、センダイウイルスを骨格とした非伝播型ベクターを開発しており、このベクターから発現させたmiRNA前駆体が、機能をもつ成熟miRNA にprocessingされることを確かめている。本研究では、細胞質でのmiRNA生成機構に焦点を当てており、昨年度、miRNA前駆体のprocessingに関与する因子を調べるために、ゲノム編集によりmiRNA processing因子をノックアウトした細胞株の作製を試みた。しかし、miRNA processing因子の欠損が細胞増殖に影響を与えるためか、目的クローンを得ることが困難であった。このため、本年度はprocessing因子ノックアウト株を蛍光レポーターの発現を指標に取得できる系の構築を試みた。得られたノックアウト株については、miRNA前駆体を発現するセンダイウイルスベクターを導入し、miRNA processing効率を検証した。さらに、miRNA前駆体の構造がprocessingに影響を与えることから、前駆体に変異やバルジを挿入し、それらがmiRNA processingに与える影響を検証した。また、miRNA前駆体と結合する因子を同定する目的で、細胞質でのprocessing効率が高いmiRNA前駆体を用いたプルダウンアッセイについても検証を行った。

センダイウイルスはネガティブ本 lockRNAをゲノムにhold つウイルスであり、dormitory Main cytoplasmic において, ウイルスゲノムのreplication and びウイルスmRNA の転WRITE を行う. I am 々は, センダイウイルスをbone pattern とした non-伝 broadcast type ベクターを开発しており,このベクターから発appears させたmiRNA pre-body が, functional をもつ mature miRNAにprocessingされることを真かめている. The focus of this study, the cytoplasmic miRNA production mechanism, the previous year, the processing of the pre-miRNA body, and the factor control, and the compilation of miRNA The processing factor is produced and tested using cell lines produced by をノックアウトした. The effects of loss of miRNA processing factors on cell proliferation are related to the effects of loss of miRNA processing factors and the difficulty of the purpose of the research.このため、This year's はprocessing factor ノックアウト区を蛍光レポーターの発existingをindexにobtained the できるsystem's のconstructed をtestみた. GET られたノックアウト strains については,miRNA former 槆体を発现するセンダイウイルスベクターを Introductionし,miRNA The processing efficiency is proven.さらに、miRNA front body structure がprocessing を and えることから、front body に変different やバルジをinsertionし、それらがmiRNA Processing is affected by processing and processing.また,miRNA pre-body and binding factor するdetermination するpurpose で,cytoplasmic でのprocessi ng efficiency is high and the pre-miRNA expression is verified by the use of high-efficiency microRNA.