新規有用タンパク質のライブラリ構築と高速スクリーニング系の基盤確立

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究においては、変異ライブラリと、w/oエマルションを利用したスクリーニング系を組み合わせ、目的機能を有する有用タンパク質を迅速かつ簡便に探索する新しい手法の構築を目指している。今年度も、昨年度に引き続き、機能評価や変異効果の検出が比較的容易と考えられる蛍光タンパク質を用いたスクリーニングのモデル系の構築を試みた。昨年度、試行錯誤の末に蛍光タンパク（野生型）を発現する組換え大腸菌の作製に成功したが、これを出発点として、蛍光タンパクの変異ライブラリの構築を試みた。ランダム変異を導入して30クローンほどサンプリングして配列を確認したところ、多種多様な変異が導入されており、変異ライブラリの調製に成功したことが確認できた。そこで、この変異ライブラリをw/oエマルションに封入・培養し、クローンの特性の違い（変異効果）を、それらが発する蛍光の違いとしてソーティングできるかどうか、について検討を行った。個々のクローン（菌体）の特性を観察するために、1 エマルション当たりの封入菌体数が1以下（複数のクローンが混在しないように、シングルコロニーもしくは空）になるように菌体濃度を調整してエマルションに封入した。封入直後では、顕微鏡でもソーターでも蛍光は検出できず、培養開始から2日後に、ようやく蛍光の検出が可能となった。これは菌体1細胞の状態（封入当日、培養0日）では蛍光の検出が難しいことを意味している。次に、この培養開始2日後のエマルションを蛍光強度の違いでソーティングし、回収したエマルションを顕微鏡で観察した。その結果、1)蛍光を発する菌体が封入されたエマルション群、2)蛍光を発しない菌体が封入されたエマルション群、3)空のエマルション群、の３つに分離できることが分かった。次の段階として、変異導入の効果を蛍光強度や蛍光波長の変化として検出可能かどうかの検証を進めたいと考えている。