Mechanism of Donor MHC Specific Tolerance Induction and Maintenance

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2021年度に作成した2種類のプラスミド（H2-KdまたはGFPのコーディングシークエンスを改変pAAVベクターに挿入したプラスミド（2020年度成果報告書参照））それぞれについてpRCベクター、pHelperベクター（いずれもAAVpro Helper Free System (AAV2): タカラバイオ）とともに無血清DMEM培地中で混合したものにTransIT-293 Trasnsfection Reagent を添加し、あらかじめ播種しておいたHEK293T細胞へのトランスフェクションを行った後さらに数日培養を行うことで、AAV産生細胞を作出した。得られた細胞を回収後、 AAV Extraction Solution （タカラバイオ）を用いてAAVベクターの抽出を行った。抽出したAAVベクターはAmiconTM Ultra-4 50 KDa （ミリポア）を用いて濃縮後、AAVpro Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2を用いてウィルスのタイターを測定し、マウスへの遺伝子導入実験に使用可能なウィルスベクター濃度であることを確認した（>107 vg/micro L）。得られた精製AAVベクターは1頭当たり200 micro L をC57/BL6マウス(雌6週齢)に尾静脈より投与し、その後継続して飼育することで肝臓へ目的遺伝子が導入されたC57/BL6マウス作製を試みた。マウスの同所肝移植による肝障害の程度と拒絶の程度を計測や血中酵素のELISAおよび組織の免疫染織法を用いて検討した。また血中の発現タンパクの増減についても検討をおこなった。また虚血後の再灌流障害の程度についてもUW液の有無による違いを検討した。