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免疫細胞を含む三次元培養皮膚モデルの構築と皮膚感作性試験法の開発

含有免疫细胞的三维培养皮肤模型的构建及皮肤致敏性测试方法的开发

基本信息

批准号：
19K12802
负责人：
赤木隆美
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、細胞表面に細胞外マトリックス（ECM）からなるナノ薄膜を形成することで三次元組織体が構築可能な細胞積層（LbL）技術を用いて、血管、リンパ管、免疫細胞などの付属器を含む真皮層・表皮層からなる三次元培養皮膚モデル（LbL-3D Skin）を構築する。得られた皮膚モデルを用いて、動物実験代替システムとしての医薬品・化粧品・化成品の安全性、有効性評価に対する基盤技術を確立する。。令和元年度においては、血管網含有LbL-3D Skinの構造と機能について評価を行った。令和2年度においては、繊維芽細胞（NHDF）からなる真皮層を構築する際に、免疫細胞であるマスト細胞と共培養を行うことで、真皮層にマスト細胞を含有するLbL-3D Skinが構築し、刺激応答性を検討した。マスト細胞含有LbL-3D Skinとして、フィブロネクチンとゼラチン（FN-G）で交互積層したNHDF（1×10^6 cells）とマスト細胞（2×10^4 cells）を混合し、真皮層を構築した。その上にヒト正常ケラチノサイト（KC）を播種し、気液界面にさらすことで、KCを分化誘導させ、表皮層の形成を行った。7日間分化誘導後、マスト細胞の脱顆粒を誘導することが知られているCompound 48/80（50, 250 ug/mL）をマスト細胞含有LbL-3D Skinに添加し、6時間培養後の培地を回収した。回収した培地中のヒスタミン量をHPLCにより定量し、皮膚モデル全体に含まれるヒスタミン量から脱顆粒の割合を算出した。マスト細胞含有LbL-3D Skinを用いた脱顆粒試験の結果、Compound 48/80に応じた濃度依存的な脱顆粒が認められ、LbL-3D Skinの真皮層に導入したマスト細胞が脱顆粒惹起物質に反応し、アレルギー反応によってヒスタミンを産生することが明らかとなった。

In this study, extracellular matrix (ECM) thin film was formed on the surface of cells, and three-dimensional tissue was constructed using LbL technology. LbL-3D Skin was constructed using vascular, endothelial, immune cell and accessory organs. To establish the safety and effectiveness evaluation of pharmaceutical, cosmetic and chemical products based on the use of skin and animal products. The vascular network contains LbL-3D Skin structure and function. In the second year of this study, we investigated the construction and stimulation of LbL-3D Skin in the co-culture of NHDF cells and immune cells. LbL-3D Skin (FN-G), NHDF (1×10^6 cells) and LbL-3D Skin (2×10^4 cells) were mixed and the true cortex was constructed. In addition, the normal growth of KC was induced by seed, liquid interface and epidermal formation. 7. After induction of differentiation in the daytime, degranulation of the cells was induced and the cells were cultured for 6 days after addition of LbL-3D Skin. HPLC method for determination of the total content of the particles in the skin The results of degranulation experiments in cells containing LbL-3D Skin showed that Compound 48/80 was concentration-dependent degranulation, and LbL-3D Skin was introduced into cells to induce degranulation.