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Elucidation of molecular mechanism of super-induced secretion of lipase and construction of useful protein mass production system

脂肪酶超诱导分泌分子机制的阐明及有用蛋白量产体系的构建

基本信息

批准号：
18K05414
负责人：
石塚盛雄
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Chuo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Stearyl alcohol(StOH、高級アルコール)等の培養培地への添加による界面活性タンパク質（EliA）とリパーゼ（lipase）超発現・超分泌、及び生分解性ポリエステルのpolyhydroxyalkanoate（PHA）の細胞内大量蓄積時に、発現量増加タンパク質の中から、プロテオーム解析によりアルコール脱水素酵素（AdhA）が同定され、その遺伝子（adhA）欠損株ではlipase生産量が低下することが判明している。相同組換え技術によりadhA相補株の作製に成功し、StOHを加えた時のAdhA・lipase活性が野生株培養時のAdhA・lipase活性と同程度まで回復したので、StOHによるlipase超発現・超分泌にはAdhAの発現が必須であることが判明した。AdhAによるStOHの酸化を経由したaldehyde、脂肪酸への酸化、β-酸化経路によるアセチルCoAの大量蓄積、生分解性ポリエステルのpolyhydroxyalkanoate（PHA）の大量蓄積経路の推定が可能になった意義は大きい。研究代表者らの今までの研究により、二種類のlipaseと一種類のカルボン酸エステルesteraseが見出され、その遺伝子配列、発現タンパク質の性質の一部が判明した。二種類のlipaseは共に50℃でも安定で、超発現誘導・分泌生産可能であり、例えばNT80-lipaseはt-buthyl-3-acetoxy-butanoate、NT92-lipaseはEthyl-2-heptanoateに良好な立体選択性を有し、部位特異的アミノ酸置換法で熱安定性に寄与するアミノ酸残基についても徐々に解明されてきたので、このままでも実用的応用が可能である。NT80-esteraseはlactone特異的酵素作用があるが、熱に不安定な為、分子進化工学的手法により12℃の熱安定性向上に成功している。

Stearyl alcohol (StOH, high-grade starch) and the like are added to the culture medium, and the interfacial activity of the surfactant (EliA), lipase, hypersecretion, and biodegradation of the surfactant (PHA) is increased when a large amount of PHA is accumulated in the cell. The production of lipase in the damaged plants is low. AdhA lipase activity in culture of wild plants was recovered to the same extent as AdhA lipase activity in culture of wild plants, and AdhA lipase activity was recovered to the same extent as AdhA lipase activity. The acidification of AdhA and StOH is mainly due to the hydrolysis, acidification of fatty acid, and β-acidification. The estimation of the accumulation pathway of CoA and PHA is of great significance. In the present study, two kinds of lipases and one kind of lipid esterase were found, and part of the properties of lipid were identified. The two lipases are stable at 50℃, hyperactive, and secreted. For example, NT80-lipase has good stereoselectivity for t-buthyl-3-acetoxy-butanoate, and NT92-lipase has good stereoselectivity for Ethyl-2-heptanoate. The site-specific acid substitution method has thermal stability, and the acid residue is stable. NT80-esterase is a lactone-specific enzyme, and its thermal stability is up to 12℃.