Elucidation of molecular mechanism of super-induced secretion of lipase and construction of useful protein mass production system

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Stearyl alcohol(StOH、高級アルコール)等の培養培地への添加による界面活性タンパク質（EliA）とリパーゼ（lipase）超発現・超分泌、及び生分解性ポリエステルのpolyhydroxyalkanoate（PHA）の細胞内大量蓄積時に、発現量増加タンパク質の中から、プロテオーム解析によりアルコール脱水素酵素（AdhA）が同定され、その遺伝子（adhA）欠損株ではlipase生産量が低下することが判明している。相同組換え技術によりadhA相補株の作製に成功し、StOHを加えた時のAdhA・lipase活性が野生株培養時のAdhA・lipase活性と同程度まで回復したので、StOHによるlipase超発現・超分泌にはAdhAの発現が必須であることが判明した。AdhAによるStOHの酸化を経由したaldehyde、脂肪酸への酸化、β-酸化経路によるアセチルCoAの大量蓄積、生分解性ポリエステルのpolyhydroxyalkanoate（PHA）の大量蓄積経路の推定が可能になった意義は大きい。研究代表者らの今までの研究により、二種類のlipaseと一種類のカルボン酸エステルesteraseが見出され、その遺伝子配列、発現タンパク質の性質の一部が判明した。二種類のlipaseは共に50℃でも安定で、超発現誘導・分泌生産可能であり、例えばNT80-lipaseはt-buthyl-3-acetoxy-butanoate、NT92-lipaseはEthyl-2-heptanoateに良好な立体選択性を有し、部位特異的アミノ酸置換法で熱安定性に寄与するアミノ酸残基についても徐々に解明されてきたので、このままでも実用的応用が可能である。NT80-esteraseはlactone特異的酵素作用があるが、熱に不安定な為、分子進化工学的手法により12℃の熱安定性向上に成功している。