βサラセミア治療薬を目指すCHTOPを標的としたスプライシング阻害剤の探索

寻找靶向 CHTOP 的剪接抑制剂来治疗 β-地中海贫血

• 批准号: 18K05350
• 负责人: 泉川 桂一
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-01 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K05350/
• 关键词: スプライシング; CHTOP; サラセミア; γグロビン; スクリーニング; βサラセミア; スプライシング阻害剤; イントロンリテンション

本研究は、βサラセミアの新規治療法として有望視されるγグロビン再発現法の確立を目標とし、γグロビンの発現抑制因子であるCHTOPに着目したスプライシング抑制剤を介するCHTOPの発現抑制法を開発すること目的としている。ヒト慢性骨髄白血病細胞株K562においてCHTOP発現低下時のγグロビン発現量の増減を検討した。電気穿孔法でのsiRNAによるCHTOPの発現抑制では、報告されているγグロビンの発現上昇が検出されなかった。赤芽球関連細胞でのCHTOP発現抑制時の効果を検証する必要があると考えられた。また、酪酸ナトリウムを用いたK562細胞の赤血球分化系を利用しCHTOP発現抑制時のヘモグロビン合成を検証した結果、CHTOPはヘモグロビン合成に影響を及ぼさないことが示唆された。次に、CHTOP pre-ｍRNAのスプライシングを感知するスクリーニング系の作製に着手した。CHTOPのmRNAはエクソン（Ex）１からEx６までで構成され、Ex２とEx３に挟まれたイントロン（Int）２がスプライシングされるとmRNAは正常に発現するが、スプライシング抑制によりInt2が残留すると、mRNA分解が誘導されCHTOPの発現量が低下する特徴がある。この特異なメカニズムを利用し、Int２のスプライシング抑制を促す薬剤を探索するためのスクリーニング系を考案した。NanoLucルシフェレースの遺伝子配列の上流にCHTOPのEx１、Ex2、Int2、Ex3、Ex4遺伝子領域を有するミニ遺伝子を構築し、これを用いたin vivoスプライシングアッセイにより、ミニ遺伝子に由来するリポーター（NanoLuc）の発現システムがCHTOPの発現量を示す指標として機能することを示し、CHTOP pre-ｍRNAに対するスプライシング抑制剤のスクリーニング系として利用可能であることを示した。

This study aims to establish a new treatment method for β-cell failure and to develop a method for inhibiting the development of CHTOP through the development of γ-cell recovery inhibitors. Study on the decrease of γ-ray production in chronic osteoblastic leukemia cell line K562 when CHTOP production was low The expression of CHTOP was inhibited by siRNA in electroporation, and the expression of CHTOP was increased by siRNA. It is necessary to investigate the effect of CHTOP inhibition in red buddle-related cells. In addition, the effect of CHTOP on the synthesis of erythrocytes in K562 cells was demonstrated when CHTOP was used to inhibit the synthesis of erythrocytes. Next, CHTOP pre-mRNA expression system was detected and the system was developed. CHTOP mRNA is composed of Ex 1, Ex6, Ex2, Ex3, Ex2, Ex3, Ex 4, Ex 6, Ex 7, Ex 8, Ex 9, Ex This article discusses the use of special media, Int2 's media, and their promotion. NanoLuc's gene sequence upstream CHTOP's Ex1, Ex2, Ex3, Ex4 gene domain has a gene structure, and is used in vivo to generate gene sequences from CHTOP's Ex 1, Ex 2, Ex3, Ex4 gene domains. CHTOP pre-mRNA expression is the most important factor in the development of gene expression.