尿細管細胞や血管内皮細胞における流れ刺激受容チャネルを介する細胞応答機構の解明

機械刺激を模した細胞培養法の確立と活性化されるシグナル経路の同定。当該年度において、近位尿細管細胞 (HK2) を用いて、物理刺激を模した培養細胞法を確立した。具体的には、本研究で購入したペリスタポンプと灌流アッセイ用のスライドチャンバーを使用し、スライドチャンバーに接着させた細胞を一晩培養したのち、流速の違いによる物理刺激を加えた。流速による物理刺激の他に、培地に過剰に加えたリン酸カルシウム結晶によって引き起こされる物理刺激実験も行った。その結果、細胞形態に変化が生じていること、また、これら刺激に応じて活性化するシグナル分子群（p38MAPKのリン酸化など）を生化学実験ならびに免疫蛍光抗体染色法によって同定した。TRPCやTRPM、TRPVに属する分子群については、それぞれの機械刺激受容チャネル分子特異的な阻害剤を添加することによって、すでに活性化することを見出したシグナル分子群が変化するかどうか、免疫蛍光抗体染色法によって確認した。しかしながら、共焦点顕微鏡レベルでは局在変化などは観察できなかった。機械刺激受容チャネルタンパク質の同定。当該年度において、近位尿細管細胞 (HK2)で発現がみられる機械刺激受容チャネル遺伝子、さらには過剰に加えたリン酸カルシウム結晶によって引き起こされる物理刺激によって増減する遺伝子群について、DNAマイクロアレイ法により同定した。近位尿細管細胞 (HK2)を用いた実験は進んでいるが、当初予定していたヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)を用いた実験がほとんど遂行できていなかった。

機械刺激を模した細胞培養法の確立と活性化されるシグナル経路の同定。当該年度において、近位尿細管細胞 (HK2) を用いて、物理刺激を模した培養細胞法を確立した。具体的には、本研究で購入したペリスタポンプと灌流アッセイ用のスライドチャンバーを使用し、スライドチャンバーに接着させた細胞を一晩培養したのち、流速の違いによる物理刺激を加えた。流速による物理刺激の他に、培地に過剰に加えたリン酸カルシウム結晶によって引き起こされる物理刺激実験も行った。その結果、細胞形態に変化が生じていること、また、これら刺激に応じて活性化するシグナル分子群（p38MAPKのリン酸化など）を生化学実験ならびに免疫蛍光抗体染色法によって同定した。TRPCやTRPM、TRPVに属する分子群については、それぞれの機械刺激受容チャネル分子特異的な阻害剤を添加することによって、すでに活性化することを見出したシグナル分子群が変化するかどうか、免疫蛍光抗体染色法によって確認した。しかしながら、共焦点顕微鏡レベルでは局在変化などは観察できなかった。機械刺激受容チャネルタンパク質の同定。当該年度において、近位尿細管細胞 (HK2)で発現がみられる機械刺激受容チャネル遺伝子、さらには過剰に加えたリン酸カルシウム結晶によって引き起こされる物理刺激によって増減する遺伝子群について、DNAマイクロアレイ法により同定した。近位尿細管細胞 (HK2)を用いた実験は進んでいるが、当初予定していたヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)を用いた実験がほとんど遂行できていなかった。