精子幹細胞におけるRNAメチル化修飾酵素の機能に関する解析

精子干细胞RNA甲基化修饰酶的功能分析

• 批准号: 18K15007
• 负责人: 佐藤 由典
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-01 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K15007/
• 关键词: 精子幹細胞; 翻訳制御; CRISPR_CAS9; エピジェネティクス; m6A修飾

[背景]ほ乳類の精子幹細胞は、種の存続という生物学的要求をかなえる上で重要な働きをもつ。その働きは、世代を超えて受け継がれてきた遺伝子情報を保全し、精子形成、受精、そして個体発生に必要な遺伝子発現の制御プログラムを構築することである。以上を深く理解し、精子産生系を生体外において論理的に再現構築することは生物学の大きな目標である。本研究は、精子幹細胞におけるRNAの転写後調節機構を解析し、種の存続を支える遺伝子発現制御プログラムの詳細を明らかにすることを目的とする。(a)　ゲノム修飾酵素の翻訳抑制機構の解析 : 　P-bodyを利用した各ゲノム修飾酵素の翻訳制御機構の有無に関して解析を行う。具体的には、精子幹細胞におけるメチル化修飾を介した未分化性維持に必須な遺伝子群の翻訳調節機構を明らかにするために、ゲノム修飾酵素 mRNAの局在を組織学的解析を行うために、新規手法として注目されるパドロックプローブを用いたFISH法の導入を進めた。精子幹細胞の未分化性維持に必須な酵素EHMT1_mRNAの検出には、改善の必要はあるものの、可視化成功した。さらに、マウス培養精原細胞株 (GS細胞) を用いて、ｍRNAの翻訳制御遺伝子の欠損を誘導するCRISPR-CAS9のレンチウイルスも構築した。(ｂ)METTL3の活性制御機構の解析 : ユビキチン化による METTL3の分解抑制について解析を行う。具体的には、、精原細胞において機能が報告されているユビキチン化酵素 NEDD4に関してMETTL3との機能的関係を生化学的に解析するため、各遺伝子の発現ベクターを構築した。

[Background] Sperm stem cells of breast are important for biological requirements. The genetic information is preserved, sperm formation, fertilization, and the control mechanism necessary for individual development is constructed. The above is a deep understanding of sperm production in vitro and logical reproduction. The purpose of this study is to analyze the post-writing regulatory mechanisms of RNA in sperm stem cells, and to clarify the detailed mechanisms of gene expression regulation in sperm stem cells. (a)Analysis of the mechanism for the inhibition of enzyme activity: P-body utilization and the presence or absence of the mechanism for the inhibition of enzyme activity Specific sperm stem cell modification is necessary for the maintenance of undifferentiated gene expression and gene regulation mechanisms. EHMT1_mRNA expression is essential for maintaining undifferentiated sperm cells. CRISPR-CAS9 gene expression system was constructed by gene expression and gene regulation in cultured spermatogonia (GS cells). (b) Analysis of METTL3 activity control mechanism: analysis of METTL3 decomposition inhibition mechanism. The specific function of spermatogonia and spermatogonia is reported. The relationship between the function of NEDD4 and METTL3 is analyzed. The development of each gene is constructed.