新規遺伝子編集技術を用いた非中心体性Ｇｏｌｇｉ微小管の伸長開始制御機構の解析

本研究においては、中心体以外から伸長する微小管の一つである Golgi微小管の伸長開始機構を明らかにすることを目的とする。技術的な問題から十分な検証が行われていなかった従来仮説「ganma -Tubulin複合体が、Golgi膜上に局在することにより開始起点が形成される」に関して検証する。検証するに当たり、Golgi膜上を点在する微小管伸長起点を免疫電顕により解析を行うにも、「微小管と Golgi膜構造を維持する固定条件では、抗体の抗原性が維持できない」といった問題を、遺伝子編集技術を用いて解決する。具体的には、TALENや CRISPR /Cas9システムを用いて、内在性 ganma-Tubulinの miniSOG-Tag標識を行う。蛍光タンパク質miniSOGは、励起光に応じて一重項酸素を産生する性質を持ち、その性質を利用することにより融合タンパク質の微細構造中の局在を標識することができ、走査電顕と同程度のより強い固定条件にも適合する利点がある。本研究においては、既存の抗体を用いた免疫電顕法と比較して、より保存された微細構造における内在性タンパク質の局在を検討する新規解析法を構築することも目標とする。最終年度において、CRISPR /Cas9システムの立ちあげを行い、内在性ganma-tubulin のminiSOGタグ標識 hTERT-RPE1細胞の樹立を試みることを中心に行なってきた。ganma-Tubulinに対する CRISPR /CAS9 plasmidおよびターゲティング配列の構築を進めた。本研究の目的達成には、miniSOG-tagを用いた内在性タンパク質の微細構造中の局在標識に関して、励起光の照射時間などの適切な条件を決める必要があったので、外来発現のminiSOG-tag付きタンパク質を安定発現した細胞を用いて、実験条件の適正化を進めた。

本研究においては、中心体以外から伸長する微小管の一つである Golgi微小管の伸長開始機構を明らかにすることを目的とする。技術的な問題から十分な検証が行われていなかった従来仮説「ganma -Tubulin複合体が、Golgi膜上に局在することにより開始起点が形成される」に関して検証する。検証するに当たり、Golgi膜上を点在する微小管伸長起点を免疫電顕により解析を行うにも、「微小管と Golgi膜構造を維持する固定条件では、抗体の抗原性が維持できない」といった問題を、遺伝子編集技術を用いて解決する。具体的には、TALENや CRISPR /Cas9システムを用いて、内在性 ganma-Tubulinの miniSOG-Tag標識を行う。蛍光タンパク質miniSOGは、励起光に応じて一重項酸素を産生する性質を持ち、その性質を利用することにより融合タンパク質の微細構造中の局在を標識することができ、走査電顕と同程度のより強い固定条件にも適合する利点がある。本研究においては、既存の抗体を用いた免疫電顕法と比較して、より保存された微細構造における内在性タンパク質の局在を検討する新規解析法を構築することも目標とする。最終年度において、CRISPR /Cas9システムの立ちあげを行い、内在性ganma-tubulin のminiSOGタグ標識 hTERT-RPE1細胞の樹立を試みることを中心に行なってきた。ganma-Tubulinに対する CRISPR /CAS9 plasmidおよびターゲティング配列の構築を進めた。本研究の目的達成には、miniSOG-tagを用いた内在性タンパク質の微細構造中の局在標識に関して、励起光の照射時間などの適切な条件を決める必要があったので、外来発現のminiSOG-tag付きタンパク質を安定発現した細胞を用いて、実験条件の適正化を進めた。