結節性硬化症責任遺伝子に変異がある皮膚細胞、神経細胞のラパマイシン応答機構

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がん抑制遺伝子TSC1、TSC2の変異による結節性硬化症では多臓器の過誤腫や精神神経症状が見られる。本研究では、TSC2遺伝子の変異に着目し、ラパマイシンによる皮膚症状、神経症状の改善メカニズムの解明を目指す。TSC1、TSC2遺伝子により産生された蛋白質は複合体を形成し、mTORC1経路を制御することで癌化を抑制する。この複合体形成不全のモデルとしてsiRNAによる遺伝子ノックダウン細胞を皮膚細胞で作成し、mTORC1経路の活性化を確認した。神経細胞へのsiRNA導入は3種類の遺伝子導入試薬とエレクトロポレーション法を用いたが予想した結果が得られなかったので、siRNAマーカーを共導入し分離すること、他の神経細胞の利用で対応することにした。神経細胞では、遺伝子変異で神経突起の伸長が変化する可能性を考え、分化を誘導し蛍光染色法で評価する方法を確認した。変異体過剰発現細胞構築のため入手した野生型TSC2遺伝子のプラスミドの情報に重大な誤りがあったため、予定外の時間を要してしまったが、神経症状の重い症例を模した変異体と変異個所を含む欠失変異体、機能ドメイン欠失変異体を作成し、発現の確認を進めた。2018年にエキソン33に変異を有する患者が多いことが示されたので、欠損変異体を作成した。複合体形成とその構成蛋白質の解析のため、免疫沈降の条件を検討した。変異体蛋白質が、未知の蛋白質と結合する可能性を考えIP-MASで複合体の構成蛋白質を解析する予定であったが、大阪北部地震で予定全体が遅れ実施に至っていない。次年度以降の検討のため、Tsc2ノックアウトマウスにラパマイシンを50日間投与し、患者で報告のある皮膚の乾燥を経時的に測定し、脳、皮膚、血液を採取し、体内のラパマイシン濃度の測定を進めた。また、頂いた患者由来の皮膚を免疫組織染色用に保存すると共に細胞を分離し、凍結保存も行っていた。