無血清培養系での歯髄由来iPS細胞の未分化性の維持に関与する細胞増殖因子群の同定

広島大学ヒトゲノム・遺伝子解斫研究倫理審査委員会にて承認を得た研究計画（承認番号第ヒ－58号）に基づき、広島大学病院顎・口腔外科を受診し、同意の得られた患者の抜去埋伏智歯より歯髄組織を採取した。無血清培地（RD6F培地）で分離培養した歯髄細胞（DPC）に、センダイウイルスベクター（SeVdp）にて遺伝子導入し、ヒトiPS細胞の誘導樹立を行った。多くの患者から単層無血清培養系でヒトiPS細胞を樹立した。次に、無血清培地hESF9培地からFgf2を除去した培地を用い、ヒトiPS細胞を本単層無血清培養系にて候補因子を添加もしくは無添加状態で培養し、添加濃度の調節、処理時間など、ヒトiPS細胞の安定した培養環境について、細胞形態や増殖能、未分化性を分析することによって検討を行っている。具体的な未分化性の検討はRT-PCR法を用いて両群の未分化マーカー遺伝子、DropletDigital PCR法を用いた未分化マーカー遺伝子と分化マーカー遺伝子の発現、FACSを用いた未分化マーカータンパクの発現解析を行っている。また、各抗体を用いてこれら蛋白の発現は蛍光免疫染色法を用いて行い、各種未分化マーカー蛋白の発現局在についても検討を行っている。多分化能については分化誘導後のヒトiPS細胞を各種分化マーカーにて染色し蛍光免疫染色共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて検鏡・観察を行った。また、免疫不全マウスの背部皮下に両群の細胞を移植しテラトーマを形成し、HE染色、アルシアンブルー/PAS染色やNestin抗体などの免疫組織染色を行う予定である。

広島大学ヒトゲノム・遺伝子解斫研究倫理審査委員会にて承認を得た研究計画（承認番号第ヒ－58号）に基づき、広島大学病院顎・口腔外科を受診し、同意の得られた患者の抜去埋伏智歯より歯髄組織を採取した。無血清培地（RD6F培地）で分離培養した歯髄細胞（DPC）に、センダイウイルスベクター（SeVdp）にて遺伝子導入し、ヒトiPS細胞の誘導樹立を行った。多くの患者から単層無血清培養系でヒトiPS細胞を樹立した。次に、無血清培地hESF9培地からFgf2を除去した培地を用い、ヒトiPS細胞を本単層無血清培養系にて候補因子を添加もしくは無添加状態で培養し、添加濃度の調節、処理時間など、ヒトiPS細胞の安定した培養環境について、細胞形態や増殖能、未分化性を分析することによって検討を行っている。具体的な未分化性の検討はRT-PCR法を用いて両群の未分化マーカー遺伝子、DropletDigital PCR法を用いた未分化マーカー遺伝子と分化マーカー遺伝子の発現、FACSを用いた未分化マーカータンパクの発現解析を行っている。また、各抗体を用いてこれら蛋白の発現は蛍光免疫染色法を用いて行い、各種未分化マーカー蛋白の発現局在についても検討を行っている。多分化能については分化誘導後のヒトiPS細胞を各種分化マーカーにて染色し蛍光免疫染色共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて検鏡・観察を行った。また、免疫不全マウスの背部皮下に両群の細胞を移植しテラトーマを形成し、HE染色、アルシアンブルー/PAS染色やNestin抗体などの免疫組織染色を行う予定である。