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タンパク質の特異的ケミカルラベル化を利用した光-電子相関顕微鏡法の開発

使用蛋白质的特定化学标记开发光电子相关显微镜

基本信息

批准号：
16K14037
负责人：
田畑栄一
金额：
$ 2.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-01 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本申請課題の目的は、蛍光顕微鏡と透過型電子顕微鏡(TEM)を併用し、タンパク質複合体を超高解像度で可視化する手法の確立である。機能性分子を標的分子に対して選択的にラベル化する手法として、申請者のグループにおいて開発したリアクティブ・タグ法を採用した。本手法では、標的タンパク質に20残基程度のペプチドタグを導入し、これを特異的に認識する合成ケミカルプローブのペアにより、標的タンパク質選択的に、不可逆的な化学標識を達成する。まずは蛍光標識、および金ナノ粒子による標識それぞれ単独でのラベル化を検討した。蛍光標識は、ラベル化に用いるケミカルプローブに蛍光色素Oregon Green 488を導入した化合物を用い、N末端にペプチドタグを融合したブラジキニン受容体B2Rをモデルタンパク質としてHEK293細胞に強制発現させて標識した。Cy5標識したアンタゴニストペプチドとの共染色で、蛍光のパターンがプローブと一致したことから、タグ特異的に蛍光標識できることが確認できた。一方、TEM用のラベル化は、ビオチンを導入したプローブで標的分子をラベル化し、さらに1.4 nmの金ナノ粒子担持ストレプトアビジン(SA)で標識することで達成した。この検討では、タグペプチドをN末端、EGFPをC末端に融合したB2RをHEK293細胞に発現させ、ディッシュ上で細胞表層のB2Rをプローブ、そして金ナノ粒子担持SAでラベルしてから固定化処理し、加圧凍結してレプリカとした。これをさらに抗GFP抗体、そして10 nmの金ナノ粒子担持二次抗体で標識し、TEMで観察した。その結果、TEMで二種類の標識が観察され、タグ特異的に金属ナノ粒子による標識を達成できていることが示唆された。低分子合成プローブを用いて金属ナノ粒子により細胞表層のタンパク質を標識、そして電顕で可視化できた例はこれまで報告がなく、リアクティブ・タグ法が従来の免疫標識法に変わる手法として有用であることが示された。

The object of the present application is to establish a method for combining optical micromirrors and transmission electron micromirrors (TEM) to visualize ultra-high resolution optical complexes. Functional molecules are selected from the group consisting of: This method allows for the introduction of a specific chemical marker at the level of 20 residues, the identification of a specific chemical marker, the identification of a specific chemical marker, and the identification of an irreversible chemical marker. The light identification, gold identification and gold identification of the particles are discussed separately. The photochrome Oregon Green 488 was introduced into HEK 293 cells and fused to HEK293 cells. Cy5 logo is the same as the color of the color In one aspect, TEM is used to detect and detect the target molecule, and the target molecule is detected and detected by 1.4 nm gold particle support (SA). The results showed that the B2R in HEK293 cells was fused at the N-terminal and C-terminal of EGFP, and the B2R in the cell surface was fused at the N-terminal and C-terminal of EGFP. The anti-GFP antibody was detected by TEM and the secondary antibody was supported by gold particles at 10 nm. The results of TEM show that the identification of two kinds of metal particles is very important. Low molecular weight synthesis using metal particles to identify the surface of the cell, and electrical visualization of the sample, such as the report, the report.