ミニセルを用いた擬似細胞触媒システムの開発

使用微细胞开发拟细胞催化系统

• 批准号: 16K14496
• 负责人: 田代 洋平
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16K14496/
• 关键词: 合成生物学; 細胞分裂; ミニセル; 遺伝子回路; バイオ生産; 代謝工学; 生体機能利用; 発酵; 酵素; 応用微生物; バイオテクノロジー

本研究は、無核小細胞（ミニセル）を放出する遺伝子システムの構築、ミニセルにおける代謝経路の構築、ミニセルへの転写機能付加の3ステップから成る。現在、第1ステップのミニセルを放出する遺伝子システムの開発を行っている。２つのタイプのミニセル化システムに取り組んでいる。ひとつめは、遺伝子の過剰発現型システムである。実施者はminE、ftsA、そしてzipAの3つの遺伝子に注目し、minEおよびftsAが無水テトラサイクリン（aTc）によって誘導される遺伝子コンストラクトを作製した。zipAは、その毒性のため、他の遺伝子と同様のコンストラクトを構築できなかった。ふたつめは、遺伝子抑制型のシステムである。minCはZリング形成部位を規定するタンパク質のひとつである。minCの発現が不足すると、細胞の中心以外の不適切な場所でZリングが形成され、その結果、ミニセルが放出される。現在、ある化合物を培地に添加した時、minC発現が抑制されるような遺伝子コンストラクトを作製中である。作製したminEの過剰発現システム（minEプラスミド）を用いて、実際にミニセルが作られるか確認した。ミニセルの確認には、β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）をコードしたColE1型プラスミド（プローブプラスミド）を利用した。プローブプラスミド上のlacZの発現はゲノム由来のlacIによって抑制されている。ラクトース不在条件では、lacZは無核であるミニセルでのみ発現されるわけである。minEプラスミドおよびプローブプラスミドを大腸菌へ導入し、その機能を確認した。この実験で、ペレットのβ-ガラクトシダーゼ活性は、aTcによって優位に増大した。aTcはminEの発現を誘導するが、lacZの発現は直接的に誘導しないため、このシグナルの増大はプローブプラスミドを内包したミニセルが生産されたためだと考えられた。

这项研究由三个步骤组成：构建一个释放小细胞（微型细胞）的基因系统，在微型细胞中构建代谢途径，并为迷你细胞增添转录功能。目前，我们正在开发一个遗传系统，该遗传系统释放了第一步的微型货币。我们正在研究两种类型的微型化系统。第一个是基因过表达系统。表演者专注于三个基因：矿山，FTSA和Zipa，并创建了基因构建体，其中矿山和FTSA是由无水四环素（ATC）诱导的。由于其毒性，Zipa无法构造与其他基因相似的构建体。第二个是基因抑制系统。 MINC是定义Z形形成部位的蛋白质之一。 MINC表达的缺乏导致在细胞中心以外的其他位置形成Z环，导致微型赛的释放。当前，正在制备基因构建体，以抑制MinC表达时，将某种化合物添加到培养基中。使用生成的矿山过表达系统（矿质粒），证实了是否实际生产了微型币。为了确认微型细胞，使用了编码β-半乳糖苷酶基因（LACZ）的COLE1质粒（探针质粒）。 LACZ在探针质粒上的表达被基因组衍生的LACI抑制。在没有乳糖的情况下，LACZ仅在非核小霉中表达。将矿质粒和探针质粒引入大肠杆菌中，并确认其功能。在此实验中，ATC主要增加了沉淀的β-半乳糖苷酶活性。尽管ATC诱导了矿山的表达，但据信，该信号的增加是由于封装探针质粒的小样细胞的产生。