グアニン４重鎖(G4)結合蛋白質を用いた機能的G4構造探索・制御技術の開発

使用鸟嘌呤四链体 (G4) 结合蛋白开发功能性 G4 结构搜索和控制技术

• 批准号: 16K14645
• 负责人: 新本 美智枝
• 金额: $ 2.41万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16K14645/
• 关键词: グアニン4重鎖; Rif1; HEATドメイン; 染色体高次構造; 染色体高次構造多量体化; 天然変性タンパク質ドメイン; DHX36; FANCJ; G4結合ドメイン; 多量体化; グアニン４重鎖DMA

グアニン４重鎖(G4)構造は代表的な非B型DNA構造でありヒトゲノム上に37万カ所以上も存在すると推定されているが、実際それがゲノム上にどのように分布し、どのような生物学的な意義を有するかは大部分未知である。本研究では、代表的な非B型DNA構造であるグアニン４重鎖構造を細胞内で網羅的に探索する新規な方法を開発し、ゲノム上での機能的グアニン４重鎖構造のプロファイル及び細胞内での局在を明らかにする。このために、まず分裂酵母と動物細胞のG4結合タンパク質Rif1のG4結合ドメインを限定した。その結果、Rif1は分裂酵母、動物細胞ともに1) N端、C端いずれのペプチドにもG4結合能力がある。2) C端はG4親和性がN端より高い。3) パラレル型のG4に高い親和性を示す。分裂酵母Rif1は、1) C末端90アミノ酸のみで多量体化(8, 16量体化)できる。2) N末端444のアミノ酸（1-444; HEAT repeat構造）もG4と結合できるが、特異性および親和性が低い。3) C端に近い保存配列を変異すると、DNA結合能が大きく低下するとともに、8, 16量体化形成能が喪失した。動物細胞Rif1は、1) 中央に存在する天然変性タンパク質ドメインにはDNA結合能は存在しない。2) 全長Rif1タンパク質のG4構造への親和性は、C端、N端ポリペプチドより1000倍ほど高い。同様に、DHX36およびFNACJ G4ヘリカーゼのG4結合ドメインも決定しつつある。これらを酵母あるいは動物細胞で発現し、ChIPSeqによりその結合部位を決定しようとしている。G4抗体BG4や、RNA-DNAハイブリッド結合プローブを用いたゲノムワイドG4やRNA-DNAハイブリッド部位と今回作製したG4結合プローブによるゲノム上G4プロファイルを比較し、細胞内機能的G4部位のゲノム上存在状態について推測する。

The G4 structure represents a non-B-type DNA structure, but its biological significance is largely unknown. This study is intended to explore new ways to develop and characterize non-B-type DNA constructs and intracellular structures. The G4 binding of yeast and animal cells is limited to the G4 binding of Rif1. The results showed that Rif1 was able to divide yeast and animal cells, and its N-terminal and C-terminal were able to bind to G4. 2)C-terminal G4 affinity N-terminal high. 3)The high affinity of G4 was shown. Split yeast Rif1, 1) C-terminal 90 2)N-terminal 444-amino acid (1-444; HEAT repeat construct) G4 binding, specificity and affinity 3)C-terminal DNA binding energy was significantly lower than that of C-terminal DNA binding energy, which was significantly lower than that of C-terminal DNA binding energy. Animal cell Rif1, 1) The central existence of natural change in the nature of the material, DNA binding ability exists. 2)The affinity of the G4 structure of the full-length Rif1 protein is 1000 times higher than that of the C-terminal and N-terminal protein. The same applies to DHX36 and FNACJ G4. The binding site of yeast and animal cells is determined by ChIPSeq. G4 antibody BG4 and RNA-DNA binding sites are used to determine whether G4 RNA-DNA binding sites are present in the G4 binding sites and whether G4 binding sites are present in the cells.