生殖細胞様細胞株を用いたｐｉＲＮＡ生合成機構の解明

使用生殖细胞样细胞系阐明 piRNA 生物合成机制

• 批准号: 18J11121
• 负责人: 住吉 哲太朗
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18J11121/
• 关键词: piRNA; ping-pong機構; l(3)mbt; Vasa; nuage; RNA-binding; iCLIP; 生殖細胞; l(3)met; vasa

本研究は、生殖細胞にて生じるpiRNA生合成機構の解明を目指して研究を進めていた。生殖細胞では、核膜近傍に存在する顆粒であるnuageでpiRNA生合成のひとつであるping-pong機構が生じると考えられており、そのコアとなるタンパク質はVasaであると考えられている。しかし、Vasaが核膜近傍に局在して顆粒を形成し、相互作用因子と共にnugaeを作る一連の機構の詳細は未解明である。そこで本研究では、新たに樹立した生殖細胞様の細胞株であるdelta-mbt-OSCを用いてnuage形成におけるVasaの役割の解析を進めた。Vasaの欠損変異体や点変異体を作製し、それらを用いて局在の解析を行ったところ、Vasaが核膜近傍へ局在し、顆粒を形成するにはRNA結合能が必要であることを示した。さらに、Vasaの局在にはVasa自身のRNA結合活性だけでなく、他のタンパク質による補助が必要な可能性をも示すことができた。また、Vasaに結合するRNAをiCLIP法により取得し、次世代シーケンサーを用いて配列の解析を行った。すると、ping-pong機構においてVasaが、AubとpiRNA、標的RNAの複合体に結合し、切断RNAを複合体から解離してAGO3にわたす際の分子メカニズムに迫ることができた。そのほか、カイコ由来細胞株であるBmN4細胞も解析に取り入れ、Vasaが相分離によって顆粒を形成する機構の解析に貢献した。さらに、VretやMaelなどの様々なnuageを構成するpiRNA生成因子の機能の解析にも貢献した。本研究ではこの様に、nuageの形成過程の解析やpiRNA生成の分析を多角的に進めることができた。

这项研究正在进行，目的是阐明生殖细胞中发生的piRNA生物合成的机制。在生殖细胞中，被认为存在于核膜附近的颗粒，被认为会产生一种乒乓机理，一种pirna生物合成之一，其核心蛋白被认为是VASA。然而，尚不清楚，在核膜附近将VASA定位在核膜附近的一系列机制的细节尚不清楚。因此，在这项研究中，我们使用新建立的类菌样细胞系Delta-MBT-OSC分析了VASA在分子形成中的作用。我们产生了VASA的突变体和点突变体，并使用它们分析了它们的定位，并表明vasa位于核膜附近，并且需要RNA结合能力来形成颗粒。此外，VASA定位不仅需要VASA自己的RNA结合活动，而且可能需要对其他蛋白质的援助。另外，通过ICLIP方法获得了RNA与VASA的结合，并使用下一代序列进行了序列分析。这使VASA与乒乓机构中的AUB，PIRNA和靶RNA的复合物结合，并在裂解RNA与复合物分离并扩散到AGO3时，仔细研究了分子机制。另外，分析中还包括蚕源细胞系BMN4细胞，有助于分析VASA通过相分离形成颗粒的机制。此外，它有助于分析构成Vret和Mael等各种细微差异的PIRNA生成因子的功能。这项研究能够对Nuage和Pirna产生的形成过程进行各种分析。

项目成果

カイコping-pong cycleにおけるAgo3-piRISCおよびVretenoの生化学解析

家蚕乒乓周期中Ago3-piRISC和Vreteno的生化分析

• 发表时间: 2019
• 作者: ○榊原和洋;西田知訓;住吉哲太朗;塩見美喜子
• 通讯作者: 塩見美喜子

Biochemical analysis of Ago3 RNP aggregates induced by failure in piRNA biogenesis in germ cells

生殖细胞中 piRNA 生物合成失败诱导的 Ago3 RNP 聚集体的生化分析

• 发表时间: 2018
• 作者: ○Sumiyoshi T;Walter B;Rene; K;Nishida KM;Siomi MC;住吉哲太朗
• 通讯作者: 住吉哲太朗

Elucidation of the molecular function of Maelstrom in the germline piRNA pathway

阐明 Maelstrom 在种系 piRNA 途径中的分子功能

• 发表时间: 2019
• 作者: Numba Y;Sato K;Sumiyoshi T;Miyata Y Siomi MC
• 通讯作者: Miyata Y Siomi MC

カイコpiRNA因子GTSFに対する抗体作製とそれを用いた生化学的解析

家蚕piRNA因子GTSF抗体的制备及生化分析

• 发表时间: 2019
• 作者: 住吉哲太朗;Walter Bronkhorst;Rene Ketting;西田知訓;塩見美喜子
• 通讯作者: 塩見美喜子

Analysis of ping-pong dependent piRNA biogenesis

乒乓依赖的 piRNA 生物发生分析

• 发表时间: 2019
• 作者: 住吉哲太朗;榊原和洋;西田知訓;塩見美喜子
• 通讯作者: 塩見美喜子