Gタンパク質のファミリー選択的なK+チャネル活性制御機構の解明

阐明G蛋白家族选择性K+通道活性调节机制

• 批准号: 18J13147
• 负责人: 加納 花穂
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18J13147/
• 关键词: Gタンパク質; イオンチャネル; 核磁気共鳴; タンパク質間相互作用; タンパク質の構造; シグナル伝達

本研究では、i/o ファミリーのG タンパク質 (Gαβγ) が選択的にGIRK を開口させる構造機構を解明するため、Gαβγ 上のGIRK 結合部位を明らかにし、選択性を決定する要因を同定することを目指した。GIRKとGタンパク質の複合体の構造情報を核磁気共鳴 (NMR) により取得するため、安定同位体標識化合物を使用した培地にてGタンパク質を発現、精製した。GIRKは非標識体を発現・精製し、脂質膜環境への再構成、常磁性試薬による修飾を施した。両者を混合した試料を所属研究室専用のNMR装置で測定し、常磁性緩和促進効果から分子間の距離情報を収集することで、GIRKとGαβγとの近接部位を明らかにした。NMR実験の結果に基づくドッキング構造計算を実行し、複数の構造のアンサンブルからなる複合体モデルを構築した。モデル構造から明らかとなった結合部位を検証するため、GIRK結合部位であるαAヘリックスを変異させたGタンパク質を作製し、GIRKとの相互作用が生じるかを検討した。その結果、野生型と比べて変異体においてはGIRKとの相互作用が減弱していたことから、モデル構造の妥当性が支持された。また、細胞内での相互作用の機能を検討した。HEK細胞を購入し各種タンパク質を発現させた。タンパク質同士の相互作用を検出するため、発光基質試薬を添加した際の生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)を観測した。受容体刺激に伴うGIRKと開口因子GβγとのBRETからGIRKの活性化を観測する実験を、i/oファミリーおよび変異体のGタンパク質を用いて行い、相互作用の有無と一致する選択性を検出できた。以上の結果を統合して、GαのαAヘリックスを介したGIRKとの結合が、活性制御の選択性を決定していると結論した。(Kano et al., Nature Communications, accepted)

This study で は, I/o フ ァ ミ リ ー の G タ ン パ ク qualitative が alpha beta gamma (G) of sentaku に GIRK を openings さ せ る construct institutions を interpret す る た め, G on the alpha beta gamma の GIRK combining site を Ming ら か に し, sentaku を decided す る by を be す る こ と を refers し た. GIRK と G タ ン パ ク qualitative の complex の structure intelligence を nuclear magnetic 気 resonance (NMR) に よ り obtain す る た め, stable isotopic body identified compounds を し use た petty に て G タ ン パ ク qualitative を 発 now, refined し た. GIRK <s:1> non-marker を occurrence · refined <s:1>, lipid membrane environment へ <s:1> reconstruction, conventional magnetic drug による modification を application た. That struck the を mixed し た sample を belongs 専 で の NMR device is used to test lab し, often magnetic ease promote unseen fruit か ら の distance between molecules intelligence を 収 set す る こ と で, GIRK と G alpha beta gamma と の nearly connect parts を Ming ら か に し た. NMR be 験 の results に づ く ド ッ キ ン グ structure calculation を line be し, plural の structure の ア ン サ ン ブ ル か ら な る complex モ デ ル を build し た. モ デ ル tectonic か ら Ming ら か と な っ た combining site を 検 card す る た め, GIRK combining site で あ る alpha A ヘ リ ッ ク ス を - different さ せ た G タ ン パ ク し, the qualitative を cropping GIRK と の interaction が raw じ る か を beg し 検 た. そ の results, wild type と than べ て - variant に お い て は GIRK と の weakened interaction が し て い た こ と か ら, モ デ ル tectonic の justice が support さ れ た. Youdaoplaceholder0, intracellular で で interaction <e:1> function を検 discuss <s:1> た. HEK cells を purchase <s:1> various タ パ パ plasmas を occurrence させた. タ ン パ ク qualitative interaction with people の を 検 out す る た め, 発 light matrix try 薬 を add し た interstate の biological 発 resonance light エ ネ ル ギ ー planning move (BRET) を 観 measuring し た. Under let body に with う GIRK と open beta gamma factor G と の BRET か ら GIRK の activeness を 観 measuring す る be 験 を, I/o フ ァ ミ リ ー お よ び - variant の G タ ン パ ク qualitative を with い て い, consistent interaction の presence of と す る sentaku sex を 検 out で き た. の above results を integration し て alpha の alpha, G A ヘ リ ッ ク ス を interface し た GIRK と の が, active suppression の sentaku sex を decided し て い る と conclusion し た. (Kano et al., Nature Communications, accepted)

项目成果

Structural elucidation of G protein family-specific regulation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channel

G蛋白门控内向整流钾通道的G蛋白家族特异性调节的结构阐明

• 发表时间: 2018
• 作者: 加納花穂;外山侑樹;今井駿輔;岩橋優太;間瀬瑶子;横川真梨子;大澤匡範;嶋田一夫
• 通讯作者: 嶋田一夫

Structural mechanism underlying G protein family-specific regulation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channel

• DOI: 10.1038/s41467-019-10038-x
• 发表时间: 2019-05-01
• 期刊: NATURE COMMUNICATIONS
• 影响因子: 16.6
• 作者: Kano, Hanaho;Toyama, Yuki;Shimada, Ichio
• 通讯作者: Shimada, Ichio