Gタンパク質のファミリー選択的なK+チャネル活性制御機構の解明

阐明G蛋白家族选择性K+通道活性调节机制

基本信息

批准号：
18J13147
负责人：
加納花穂
金额：
$ 0.96万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、i/o ファミリーのG タンパク質 (Gαβγ) が選択的にGIRK を開口させる構造機構を解明するため、Gαβγ 上のGIRK 結合部位を明らかにし、選択性を決定する要因を同定することを目指した。GIRKとGタンパク質の複合体の構造情報を核磁気共鳴 (NMR) により取得するため、安定同位体標識化合物を使用した培地にてGタンパク質を発現、精製した。GIRKは非標識体を発現・精製し、脂質膜環境への再構成、常磁性試薬による修飾を施した。両者を混合した試料を所属研究室専用のNMR装置で測定し、常磁性緩和促進効果から分子間の距離情報を収集することで、GIRKとGαβγとの近接部位を明らかにした。NMR実験の結果に基づくドッキング構造計算を実行し、複数の構造のアンサンブルからなる複合体モデルを構築した。モデル構造から明らかとなった結合部位を検証するため、GIRK結合部位であるαAヘリックスを変異させたGタンパク質を作製し、GIRKとの相互作用が生じるかを検討した。その結果、野生型と比べて変異体においてはGIRKとの相互作用が減弱していたことから、モデル構造の妥当性が支持された。また、細胞内での相互作用の機能を検討した。HEK細胞を購入し各種タンパク質を発現させた。タンパク質同士の相互作用を検出するため、発光基質試薬を添加した際の生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)を観測した。受容体刺激に伴うGIRKと開口因子GβγとのBRETからGIRKの活性化を観測する実験を、i/oファミリーおよび変異体のGタンパク質を用いて行い、相互作用の有無と一致する選択性を検出できた。以上の結果を統合して、GαのαAヘリックスを介したGIRKとの結合が、活性制御の選択性を決定していると結論した。(Kano et al., Nature Communications, accepted)

在这项研究中，我们旨在阐明G蛋白（Gαβγ）的I/O家族有选择地打开GIRK的结构机制，并通过揭示GIRK结合位点上的Gαβγ上的GIRK结合位点来识别确定选择性的因素。为了通过核磁共振（NMR）获得GIRK-G蛋白复合物的结构信息，使用稳定的同位素标记化合物在培养基中表达G蛋白。通过将未标记的产物表达和重构为脂质膜环境，并用顺磁试剂对其进行修改，从而表达和纯化了Girk。使用专用于实验室的NMR系统测量了包含两者的样品，并从顺磁性弛豫促进效应中收集了分子间距离信息，揭示了Girk和Gαβγ的接近度。进行了基于NMR实验结果的对接结构计算，以构建由多个结构集合组成的复杂模型。为了验证从模型结构揭示的结合位点，我们创建了一个G蛋白，该G蛋白突变αA螺旋（Girk结合位点），并检查它是否会引起与Girk的相互作用。结果，与野生型相比，在突变体中减弱了与Girk的相互作用，从而支持模型结构的有效性。另外，研究了细胞内相互作用的功能。购买HEK细胞并表达各种蛋白质。为了检测蛋白质相互作用，当加入发光底物试剂时，观察到生物发光共振能传递（BRET）。我们进行了一项实验，以观察Girk Bret的GIRK激活，并使用I/O家族的G蛋白和突变体G蛋白的G蛋白与受体刺激相关的开头因子Gβγ，并且检测到与存在或不存在相互作用一致的选择性。通过结合这些结果，我们得出结论，Gα通过αA螺旋与GIRK结合决定了活性控制的选择性。（Kano等人，自然通讯，接受）