結合タンパク質の網羅的な解析を指向したタンパク質ラベル化法の開発

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前年度までに、アフィニティービーズ上で有機光触媒のスクリーニングを行った。従来まで用いていたRu/dcbpy錯体には効率は劣るものの、Acriflavin、BODIPY、Coumarinなど蛍光プローブとして汎用される種々の分子がタンパク質ラベル化触媒となることを見出した。これらの有機光触媒は十分な細胞膜透過性を有する。このことから上記で見出した光触媒は生きた細胞内でタンパク質をラベル化できるポテンシャルを秘めている。モデル系として、HEK293FT細胞中膜上にHaloTag-TM（Transmembrane domain of PDGFR）を遺伝子工学的に強制発現させた。このHaloTagに対して前年度に見出されてきた有機光触媒を共有結合で連結し、可視光照射条件下、HaloTag-TMのラベル化を試みた。平面性かつカチオン性を有するAcriflavinを用いることで、HaloTag上で解析対象タンパク質や相互作用タンパク質を効率よくラベル化することに成功した。Acriflavine光触媒を用い、10 nm程度の直径のタンパク質含有複合体nucleosomeに対して本ラベル化法を適用した。H2BをPOIとしたラベル化を実施したところ、細胞内環境においてもacriflavineはHaloTag-POI上で近接ラベル化反応を可能にすることが明らかとなった。本法は1分間の可視光照射という迅速かつ温和な条件で、従来法よりも局所的空間でPOIおよび相互作用タンパク質をラベル化できる。そのため、本法によってH2Bの関連タンパク質やH2Bと非常に近い距離に存在するH2Aの関連タンパク質を選択的にラベル化できることが明らかとなった。本研究で開発したラベル化法は6 nmのラベル化半径もつことから細胞内微小環境における隣接したPPIを高精度に解析できる初めての手法である。