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結合タンパク質の網羅的な解析を指向したタンパク質ラベル化法の開発

开发用于综合分析结合蛋白的蛋白质标记方法

基本信息

批准号：
18J21621
负责人：
對馬理彦
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までに、アフィニティービーズ上で有機光触媒のスクリーニングを行った。従来まで用いていたRu/dcbpy錯体には効率は劣るものの、Acriflavin、BODIPY、Coumarinなど蛍光プローブとして汎用される種々の分子がタンパク質ラベル化触媒となることを見出した。これらの有機光触媒は十分な細胞膜透過性を有する。このことから上記で見出した光触媒は生きた細胞内でタンパク質をラベル化できるポテンシャルを秘めている。モデル系として、HEK293FT細胞中膜上にHaloTag-TM（Transmembrane domain of PDGFR）を遺伝子工学的に強制発現させた。このHaloTagに対して前年度に見出されてきた有機光触媒を共有結合で連結し、可視光照射条件下、HaloTag-TMのラベル化を試みた。平面性かつカチオン性を有するAcriflavinを用いることで、HaloTag上で解析対象タンパク質や相互作用タンパク質を効率よくラベル化することに成功した。Acriflavine光触媒を用い、10 nm程度の直径のタンパク質含有複合体nucleosomeに対して本ラベル化法を適用した。H2BをPOIとしたラベル化を実施したところ、細胞内環境においてもacriflavineはHaloTag-POI上で近接ラベル化反応を可能にすることが明らかとなった。本法は1分間の可視光照射という迅速かつ温和な条件で、従来法よりも局所的空間でPOIおよび相互作用タンパク質をラベル化できる。そのため、本法によってH2Bの関連タンパク質やH2Bと非常に近い距離に存在するH2Aの関連タンパク質を選択的にラベル化できることが明らかとなった。本研究で開発したラベル化法は6 nmのラベル化半径もつことから細胞内微小環境における隣接したPPIを高精度に解析できる初めての手法である。

In the past year, the organic photocatalyst industry has been developing rapidly. In the past, the Ru/dcbpy complex was used to improve the efficiency of the catalyst. Acriflavin, BODIPY, Coumarin and other molecules were used to improve the catalyst efficiency. The organic photocatalyst is very transparent to the cell membrane. The photocatalysts were produced in the cells. HaloTag-TM (Transmembrane domain of PDGFR) on HEK293FT cells This HaloTag was found in the previous year, and the organic photocatalyst was combined with the visible light irradiation condition. planarity, quality, interaction, efficiency, etc. Acriflavine photocatalyst has a diameter of about 10 nm and contains complex nucleosomes. H2B POI and H2B POI are closely related to the intracellular environment. This method is based on a minute of visible light irradiation, rapid change in temperature conditions, and rapid change in quality. This method is used to determine the relationship between H2B and H2B, and to determine the relationship between H2A and H2B at very close distances. In this study, we developed a new method for analyzing the cellular microenvironment with high accuracy, namely, the 6 nm radius of polarization.