結合タンパク質の網羅的な解析を指向したタンパク質ラベル化法の開発

开发用于综合分析结合蛋白的蛋白质标记方法

基本信息

批准号：
18J21621
负责人：
對馬理彦
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までに、アフィニティービーズ上で有機光触媒のスクリーニングを行った。従来まで用いていたRu/dcbpy錯体には効率は劣るものの、Acriflavin、BODIPY、Coumarinなど蛍光プローブとして汎用される種々の分子がタンパク質ラベル化触媒となることを見出した。これらの有機光触媒は十分な細胞膜透過性を有する。このことから上記で見出した光触媒は生きた細胞内でタンパク質をラベル化できるポテンシャルを秘めている。モデル系として、HEK293FT細胞中膜上にHaloTag-TM（Transmembrane domain of PDGFR）を遺伝子工学的に強制発現させた。このHaloTagに対して前年度に見出されてきた有機光触媒を共有結合で連結し、可視光照射条件下、HaloTag-TMのラベル化を試みた。平面性かつカチオン性を有するAcriflavinを用いることで、HaloTag上で解析対象タンパク質や相互作用タンパク質を効率よくラベル化することに成功した。Acriflavine光触媒を用い、10 nm程度の直径のタンパク質含有複合体nucleosomeに対して本ラベル化法を適用した。H2BをPOIとしたラベル化を実施したところ、細胞内環境においてもacriflavineはHaloTag-POI上で近接ラベル化反応を可能にすることが明らかとなった。本法は1分間の可視光照射という迅速かつ温和な条件で、従来法よりも局所的空間でPOIおよび相互作用タンパク質をラベル化できる。そのため、本法によってH2Bの関連タンパク質やH2Bと非常に近い距離に存在するH2Aの関連タンパク質を選択的にラベル化できることが明らかとなった。本研究で開発したラベル化法は6 nmのラベル化半径もつことから細胞内微小環境における隣接したPPIを高精度に解析できる初めての手法である。

直到上一年，在亲和力珠上筛选有机光催化剂。尽管到目前为止使用的RU/DCBPY复合物的效率较小，但已经发现，已经发现各种分子（例如尖脂质，Bodipy和香豆素）通常用作荧光探针，可以用作蛋白质标记的蛋白质标记。这些有机光催化剂具有足够的细胞膜渗透性。由此，上面发现的光催化剂具有在活细胞内标记蛋白质的潜力。作为模型系统，对HALOTAG-TM（PDGFR的跨膜结构域）进行了基因工程，以在HEK293FT细胞的内侧膜上迫使表达。上一年发现的有机光催化剂与该吊带有共价链接，并在可见的光照射条件下尝试了Halotag-TM的标记。通过使用具有平面和阳离子特性的acriflavin，我们成功地在Halotag上成功地标记了要分析的蛋白质和相互作用的蛋白质。使用acriflavine光催化剂，将此标记方法应用于直径约为10 nm的核小体的含蛋白质复合物。当将H2B标记为POI时，据表明，即使在细胞内环境中，Acriflavine也可以在Halotag-POI上进行接近标记反应。这种方法允许在快速和轻度条件下的常规方法中标记POI和相互作用的蛋白质，并具有1分钟的可见光照射。因此，已经揭示了该方法可以选择性地标记H2B相关蛋白质和与H2a相关的蛋白，这些蛋白质与H2B非常近的距离。这项研究中开发的标记方法的标记半径为6 nm，这是第一种允许对细胞内微环境中相邻PPI进行高精度分析的方法。