EF-P改変による翻訳導入可能な非天然アミノ酸種の拡充

通过修饰 EF-P 扩展可翻译的非天然氨基酸种类

• 批准号: 22KJ0865
• 负责人: 金山 大輝
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0865/
• 关键词: 試験管内翻訳; 翻訳伸長因子P; 人工進化

本研究は、試験管内で翻訳導入可能な非天然アミノ酸種を拡充するため、翻訳伸長因子Pを人工進化することを目標としている。天然の翻訳伸長因子Pは、細菌中でプロリン連続配列の翻訳導入を促進する働きを持つが、再構成試験管内翻訳系においても一部の非天然アミノ酸の翻訳導入を促進あるいは抑制することが知られている。そこで、導入する非天然アミノ酸種に応じて翻訳伸長因子Pを最適化することで、導入可能な非天然アミノ酸種を拡充できると期待される。翻訳伸長因子Pは188残基のアミノ酸から構成されるタンパク質であるが、その中で最も翻訳反応に影響を及ぼすと考えられている、34残基目のアミノ酸に様々な変異を加えることとした。本年度はまず、天然アミノ酸のみで構成された翻訳伸長因子P変異体をモデルタンパク質として、発現系の構築に取り組んだ。発現系には、非天然アミノ酸を含んだ翻訳伸長因子P変異体ライブラリ構築に有利であると考えられる、大腸菌由来の試験管内翻訳系を採用した。既存の翻訳系では翻訳量が著しく低かったため、質量分析装置で翻訳産物を検出できなかった。そこで、各翻訳因子や核酸の濃度等を最適化することで、十分量の翻訳伸長因子Pを得ることに成功した。発現した翻訳伸長因子Pの濃縮・精製方法や、放射性ラベル化されたアミノ酸を用いた翻訳伸長因子Pの活性評価方法の検討も行った。現在は様々な非天然アミノ酸を含有した翻訳伸長因子Pの翻訳合成を行っている。

In this study, the possibility of introducing non-natural acid species into the tube and the purpose of artificial evolution of the elongation factor P were investigated. Natural turnover elongation factor P, bacterial turnover alignment, promotion, maintenance, reconstruction of the turnover system in the test tube, part of the non-natural turnover acid, promotion, inhibition, knowledge and technology For example, the introduction of non-natural acid species may optimize the elongation factor P, and the introduction of non-natural acid species may be desirable. The length of the protein is 188 residues, and the length of the protein is 34 residues. This year, the composition of natural acids, the elongation factor P, and the structure of the discovery system were selected. The discovery system is composed of natural and non-natural acids, elongation factors, and the construction of heterotrophic bacteria. The quality of the product is determined by the quality analysis device. For example, the concentration of nucleic acid and the transformation factors were optimized. A method for the concentration and purification of the elongation factor P, a method for the activity evaluation of the elongation factor P, and a method for the radioactivity analysis of the elongation factor P were developed. The present invention relates to a method for synthesizing a non-natural acid containing an elongation factor P