Elucidation of biosynthetic mechanism of diazo group-containing amino acid and the application to novel amino acid production system

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申請者らは過去に、放線菌が生産するジアゾ基含有アミノ酸、6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) の生合成経路において、新規ファミリーの膜タンパク質であるAzpLがジアゾ化反応を触媒することを同定したが、組換えタンパク質の取得には至っていなかった。本年度はAzpLのC末端にGFPを融合させることで、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現・精製に成功し、試験管内でその活性を確かめることができた。AzpLは既知のジアゾ化酵素と異なり、ATPなどの補因子や補酵素をその活性に必要としないことが分かり、反応機構が根本的に異なることが示唆された。Streptomyces sp. RI-77株が有するジアゾ化反応に必要な遺伝子を含む未知の生合成遺伝子クラスター (avaクラスター) について、異種発現実験によるゲノムマイニングを行ったところ、本クラスターの遺伝子産物がアベナルミ酸を生産することが分かった。各遺伝子破壊株の代謝解析や組換えタンパク質の試験管内解析から全生合成経路を解明した。この経路には、芳香族アミノ基のジアゾ化とジアゾ基へのNADPH由来のヒドリド転移による脱離反応を介した新規なアミノ基除去機構が存在することを明らかにした。更に、ジアゾ化を担うAvaA6のホモログ酵素 (CmaA6) について、X線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡法による解析から、現在までにテトラマーを形成する全体構造を解明した。アベナルミ酸の生合成中間体である、3-ジアゾアベナルミ酸生産菌の培養液に、アセトアセタニライドとその誘導体を添加したところ、細胞内でジアゾ基と活性メチレンが非酵素的にカップリング反応を起こし、フェニルジアゼン骨格を有する新規化合物を生産することがわかった。