Elucidation of biosynthetic mechanism of diazo group-containing amino acid and the application to novel amino acid production system

含重氮氨基酸生物合成机制的阐明及其在新型氨基酸生产系统中的应用

• 批准号: 22KJ1046
• 负责人: 川合 誠司
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1046/
• 关键词: 放線菌; 生合成; ジアゾ基; 非リボソームペプチド合成酵素; ポリケタイド合成酵素; X線結晶構造解析; クライオ電子顕微鏡; 二次代謝

申請者らは過去に、放線菌が生産するジアゾ基含有アミノ酸、6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) の生合成経路において、新規ファミリーの膜タンパク質であるAzpLがジアゾ化反応を触媒することを同定したが、組換えタンパク質の取得には至っていなかった。本年度はAzpLのC末端にGFPを融合させることで、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現・精製に成功し、試験管内でその活性を確かめることができた。AzpLは既知のジアゾ化酵素と異なり、ATPなどの補因子や補酵素をその活性に必要としないことが分かり、反応機構が根本的に異なることが示唆された。Streptomyces sp. RI-77株が有するジアゾ化反応に必要な遺伝子を含む未知の生合成遺伝子クラスター (avaクラスター) について、異種発現実験によるゲノムマイニングを行ったところ、本クラスターの遺伝子産物がアベナルミ酸を生産することが分かった。各遺伝子破壊株の代謝解析や組換えタンパク質の試験管内解析から全生合成経路を解明した。この経路には、芳香族アミノ基のジアゾ化とジアゾ基へのNADPH由来のヒドリド転移による脱離反応を介した新規なアミノ基除去機構が存在することを明らかにした。更に、ジアゾ化を担うAvaA6のホモログ酵素 (CmaA6) について、X線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡法による解析から、現在までにテトラマーを形成する全体構造を解明した。アベナルミ酸の生合成中間体である、3-ジアゾアベナルミ酸生産菌の培養液に、アセトアセタニライドとその誘導体を添加したところ、細胞内でジアゾ基と活性メチレンが非酵素的にカップリング反応を起こし、フェニルジアゼン骨格を有する新規化合物を生産することがわかった。

Applicants ら は past に, actinomyces が production す る ジ ア ゾ base contains ア ミ ノ acid, 6 - diazo - 5 - oxo - L - norleucine (DON) の biosynthesis 経 road に お い て, new rules フ ァ ミ リ ー の membrane タ ン パ ク qualitative で あ る AzpL が ジ ア ゾ turn against 応 を catalyst す る こ と を with fixed し た が, group in え タ ン パ ク qualitative の obtain に は to っ て い な か っ た. This year は AzpL の C terminal に GFP fusion を さ せ る こ と で, coliform を い た group in え タ ン パ ク qualitative の 発 refined に し success and now the test tube で そ の active を か indeed め る こ と が で き た. AzpL は already know の ジ ア ゾ phenoloxidase と different な り, ATP な ど darned の factor や enzyme を そ の active に necessary と し な い こ と が points か り, anti が 応 establishment に different な る こ と が in stopping さ れ た. Streptomyces sp. RI - 77 strains が す る ジ ア ゾ turn against 応 に necessary な heritage 伝 son を containing unknown む の biosynthesis heritage 伝 son ク ラ ス タ ー (ava ク ラ ス タ ー) に つ い て, heterogeneous 発 now be 験 に よ る ゲ ノ ム マ イ ニ ン グ を line っ た と こ ろ, this ク ラ ス タ ー の heritage 伝 zi chan content が ア ベ ナ ル を ミ acid production す る こ と が points か っ た. Metabolic analysis of each 伝 subplant 壊 strain や group exchange えタ <s:1> パ <s:1> mass exchange <s:1> パ <s:1> tube analysis ら ら total biosynthetic pathway を explanation of た. こ の 経 road に は, aromatic ア ミ ノ base の ジ ア ゾ change と ジ ア ゾ base へ の NADPH origin の ヒ ド リ ド planning move に よ る from reverse 応 を interface し た new rules な ア ミ ノ base to remove body が exist す る こ と を Ming ら か に し た. More に, ジ ア ゾ change を bear う AvaA6 の ホ モ ロ グ enzyme (CmaA6) に つ い て, X-ray crystal structure analytic と ク ラ イ オ electronic 顕 micro mirror method に よ る parsing か ら, now ま で に テ ト ラ マ ー を form す る all the tectonic を interpret し た. ア ベ ナ ル の ミ acid biosynthesis intermediate で あ る, 3 - ジ ア ゾ ア ベ ナ ル ミ acid producing bacteria に の broth, ア セ ト ア セ タ ニ ラ イ ド と そ の inductor を add し た と こ ろ, intracellular で ジ ア ゾ base と active メ チ レ ン が non enzyme に カ ッ プ リ ン グ anti 応 を up こ し, フ ェ ニ ル ジ ア ゼ ン bone を have す る new rules compound を production す る Youdaoplaceholder0 とがわ った.

项目成果

ジアゾ基含有トリペプチド：アラゾぺプチンの全生合成機構

含重氮基的三肽：阿拉佐肽的完整生物合成机制

• 发表时间: 2022
• 期刊: バイオサイエンスとインダストリー（Ｂ＆Ｉ）
• 作者: 川合誠司;勝山陽平;大西康夫
• 通讯作者: 大西康夫

Bacterial Avenalumic Acid Biosynthesis Includes Substitution of an Aromatic Amino Group for Hydride by Nitrous Acid Dependent Diazotization

• DOI: 10.1002/anie.202211728
• 发表时间: 2022-10-07
• 期刊: ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION
• 影响因子: 16.6
• 作者: Kawai, Seiji;Hagihara, Ryota;Ohnishi, Yasuo
• 通讯作者: Ohnishi, Yasuo

Avenalumic acid biosynthesis includes substitution of an aromatic amino group for hydride via nitrous acid-dependent diazotization in Streptomyces sp. RI-77.

Avenalumic 酸生物合成包括通过链霉菌中的亚硝酸依赖性重氮化作用用芳香族氨基取代氢化物。

• 发表时间: 2023
• 作者: Kawai Seiji;Shin‐ya Kazuo;Katsuyama Yohei;Ohnishi Yasuo
• 通讯作者: Ohnishi Yasuo

放線菌が生産するavenalumic acid生合成におけるジアゾ化を介した脱アミノ化機構の発見

放线菌产生的燕麦酸生物合成中重氮化介导的脱氨机制的发现

• 发表时间: 2022
• 作者: 川合誠司;新家一男;勝山陽平;大西康夫
• 通讯作者: 大西康夫

放線菌由来芳香族ジアゾ基含有天然物生合成経路を利用したフェニルジアゼン誘導体の微生物生産

利用源自放线菌的含芳香族重氮基天然产物的生物合成途径微生物生产苯基二氮烯衍生物

• 发表时间: 2023
• 作者: 川合誠司;勝山陽平;大西康夫
• 通讯作者: 大西康夫