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Elucidation of biosynthetic mechanism of diazo group-containing amino acid and the application to novel amino acid production system

含重氮氨基酸生物合成机制的阐明及其在新型氨基酸生产系统中的应用

基本信息

批准号：
22KJ1046
负责人：
川合誠司
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

申請者らは過去に、放線菌が生産するジアゾ基含有アミノ酸、6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) の生合成経路において、新規ファミリーの膜タンパク質であるAzpLがジアゾ化反応を触媒することを同定したが、組換えタンパク質の取得には至っていなかった。本年度はAzpLのC末端にGFPを融合させることで、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現・精製に成功し、試験管内でその活性を確かめることができた。AzpLは既知のジアゾ化酵素と異なり、ATPなどの補因子や補酵素をその活性に必要としないことが分かり、反応機構が根本的に異なることが示唆された。Streptomyces sp. RI-77株が有するジアゾ化反応に必要な遺伝子を含む未知の生合成遺伝子クラスター (avaクラスター) について、異種発現実験によるゲノムマイニングを行ったところ、本クラスターの遺伝子産物がアベナルミ酸を生産することが分かった。各遺伝子破壊株の代謝解析や組換えタンパク質の試験管内解析から全生合成経路を解明した。この経路には、芳香族アミノ基のジアゾ化とジアゾ基へのNADPH由来のヒドリド転移による脱離反応を介した新規なアミノ基除去機構が存在することを明らかにした。更に、ジアゾ化を担うAvaA6のホモログ酵素 (CmaA6) について、X線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡法による解析から、現在までにテトラマーを形成する全体構造を解明した。アベナルミ酸の生合成中間体である、3-ジアゾアベナルミ酸生産菌の培養液に、アセトアセタニライドとその誘導体を添加したところ、細胞内でジアゾ基と活性メチレンが非酵素的にカップリング反応を起こし、フェニルジアゼン骨格を有する新規化合物を生産することがわかった。

Applicant らは上に、Actinomyces がproduced するジアゾbase contains aminic acid, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON)の生综合経路において、新码ファミリーの片タンパク性であるAzpLがジアゾ化Reaction Catalyst することを Same Set したが, Group Change えタンパクquality のGet には to っていなかった. This year, AzpL's C-terminal GFP was fused and Escherichia coli was replaced. The quality of the タンパク has been successfully refined, and the activity of the でその in the test tube has been confirmed. AzpL is a well-known enzyme enzyme, ATP supplement factor, and enzyme enzyme activity. Sexuality is necessary and necessary, and the reaction mechanism is fundamental and different. Streptomyces sp. RI-77 strain が有するジアゾchemical reaction 応に Required な伝子を contain む Unknown の生综合人伝子クラスター (avaクラスター)について、different species 発 appear実験によるゲノムマイニングを行ったところ、本The product of クラスターの缝子, がアベナルミ acid を, is produced by することが分かった. Metabolic analysis of each genetically modified strain was carried out, and the composition and quality of each strain were analyzed in vitro. NADPH origin of NADPH転动によるbreaks off the 濜をINSukeした新regulationなアミノbase removal mechanismがexistingすることを明らかにした. Genta, ジアゾを恆AvaA6 enzyme (CmaA6)について, X-ray crystal structure analysis とクライオelectronic microscopic analysis によるから, and now までにテトラマーを formation するwhole structure を clarification した. Biosynthetic intermediates of amaranic acid and 3-amalanic acid-producing bacteria Culture medium, アセトアセタニライドとその inducer を added したところ, cells Inner でジアゾとActive メチレンが non-enzyme にカップリングanti-をこし,フェニルジアゼンを有するNew Regulation Compound を is produced by することがわかった.