Rejuvenation of aged neural stem cells through gene induction

通过基因诱导使衰老的神经干细胞恢复活力

• 批准号: 22KJ1659
• 负责人: 佐伯(馬場) 麻悠子 (2022-2023)
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1659/
• 关键词: 神経新生; 神経幹細胞; 霊長類; 遺伝子導入; ウイルスベクター

令和3年度は成体サル脳の左半球の脳室下帯に目的遺伝子を搭載したウイルスベクターを、右半球にはコントロールのベクターを注射し、1カ月後に固定し、脳切片の作製、免疫染色を行い、左右で感染細胞のうち分裂する細胞の割合に差があるか確認した。令和3年度に行ったサル脳切片の免疫染色ではウイルスベクターの注射部位を使っていたが、針が通過した跡に沿ったDCX陽性細胞の増生をみとめ、また、ウイルス濃度が濃い部分はウイルスによるダメージで脳が線維化しており遺伝子導入による効果の評価が難しかった。令和4年度は切片を明視野顕微鏡で針の通過部位を記録し注射部位から前後150um離れた部位を同定した。追加染色では前後150umを染色し、神経新生の評価の対象とした。また、ウイルスベクターを作製し力価は細胞に感染させて測定していたが、蛍光タンパクの発現効率が効果が期待されるベクターとコントロールベクターで異なったため、見かけ上は揃っていても実際はタイターが揃えられていなかったと考えられたこれまでに得られた結果では、蛍光タンパクmcherryをウイルスベクターに発現させることで感染細胞を標識し、そのうち分裂細胞であるBrdU陽性細胞の割合をカウントしたところ、目的遺伝子を搭載したベクターを注射した左側がBrdU陽性細胞の割合は多かったが、左右で注射したウイルスの力価が異なったことが推測されるため、今回の実験からは、遺伝子導入によって細胞増殖が促進されたということは難しい。ウイルスベクターはHES5プロモーターを使用しその下流の目的遺伝子と蛍光タンパクを発現させた。mcherry陽性細胞がいずれの細胞であるか確認するために免疫染色を行ったところ、GFAP陽性であった。DCXの発現はかなり弱く、非特異的反応である可能性も考えられたが、mcherryとGFAP陽性細胞の近くにDCX陽性細胞が存在する傾向にあった。

In the third year of this year, the target gene was loaded into the left hemisphere of the adult brain, and the target gene was injected into the right hemisphere of the adult brain. One month later, the fixation, the preparation of the sections, the immunostaining, and the differentiation of the infected cells between the left and right sides were confirmed. In the third year, immunostaining of the injection site was performed to evaluate the effect of DCX positive cells in the injection site. In the fourth year, the injection site was recorded before and after 150um, and the site was determined at the same time. Additional staining before and after 150um staining, new brain evaluation For example, if you want to test the cell infection rate, you can test the cell infection rate. If you want to test the cell infection rate, you can test the cell infection rate. If you want to test the cell infection rate, you can test the cell infection rate. If you want to test the cell infection rate, you can test the cell infection rate. If you want to test the cell infection rate, you can test the cell infection rate. The infected cells were identified, divided, and injected with BrdU-positive cells on the left and right sides. The infected cells were identified, divided, and injected with BrdU-positive cells on the left and right sides. The gene is introduced into the cell to promote cell proliferation. The use of HES5 Promo TV and the discovery of low-level target proteins and light boxes have been announced. mcherry positive cells were identified by immunostaining. DCX expression is weak and non-specific, and there is a tendency for GFAP positive cells and DCX positive cells to be present.