PCR合成DNAによる革新的な新規遺伝子発現抑制RNAi技術の開発

使用 PCR 合成 DNA 开发创新的新型基因表达抑制 RNAi 技术

• 批准号: 25660080
• 负责人: 中村 美紀子
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25660080/
• 关键词: RNA interference; PCR; 遺伝子ノックダウン; 遺伝子ノックダウン技術; RNA干渉; siRNA配列

遺伝子機能を解明するため、目的の遺伝子発現のみを抑制するRNA干渉（RNAi)技術が汎用されているが、RNAiに用いられる配列によっては目的の遺伝子発現を完全に抑制させることができないことが多々ある。これは、RNAi配列の設計が経験則に頼っており、未だ理論的な法則が見出されていないために、最適な配列が用いられていないからである。そこで、RNAi配列の法則性を明らかにし、その設計方法の確立を目指した。まず、安定にRNAi効果を測定できる感度の良い測定方法の確立を目指した。最初はヒト化コドンのルシフェラーゼ遺伝子を用いたが安定な測定方法を確立できなかったので、ヒト化コドン緑色蛍光タンパク質EGFPに変更し、EGFPで安定な測定方法を確立した。次に、RNAi配列の法則性を見出すために様々なEGFPに対するRNAi配列を設計し、PCRでコンストラクトの作製を試みたが、設計したほとんどの配列がPCRで増幅できなかった。そこでPCRによるコンストラクト作製技術の開発をはじめた。DNAポリメラーゼ、PCR条件、コンストラクト（種々のプロモータ、RNAi配列の長さ、ターミネータなど）など、様々な条件を検討し、RNAiコンストラクトをPCRで作製できるようにした。次に、開発したコンストラクト作製技術を用いて様々なRNAi配列を作製し、RNAi効果の検証を行った。その結果、RNAi効果のある配列とない配列を区別することができた。次に、効果のあった配列について１塩基変異を導入しRNAi効果に重要な配列を調べたが、１塩基置換ではRNAi効果は減少しなかった。そこで更なる変異を加えることでRNAi効果に重要な配列を明らかにすることを目指した。他の遺伝子についてもRNAi効果を示す配列を見出すことでRNAi効果を示す配列の法則性を明らかにするため、20種類の候補ヒト遺伝子をクローニングした。

RNA interference (RNAi) technology has been widely used to detect and suppress the expression of target genes. The design of RNAi alignment is based on the principle of non-theoretical alignment, and the optimal alignment is used. The rules of RNAi alignment are clearly defined and the design methods are established. The purpose of this study is to establish a method for determining the sensitivity of RNAi and its stability. Initially, the stability determination method of EGFP was established in the application of EGFP. Second, RNAi alignment rules are found in the design of EGFP alignment, PCR alignment and PCR amplification. The development of PCR technology DNA sequencing, PCR conditions, RNA sequencing, RNA sequencing, DNA sequencing, RNA sequencing, DNA sequencing In the second place, the development of RNAi production technology, RNAi alignment, RNAi effect demonstration The results of RNAi are different. The effect of RNAi is to reduce the effect of RNAi by adjusting the effect of RNAi and substituting the effect of RNAi. The difference between the two is that the two are different. The RNAi effect is shown in the table below. The RNAi effect is shown in the table below. There are 20 types of candidate vectors.

项目成果

A Novel Terminator Primer and Enhancer Reagents for Direct Expression of PCR-Amplified Genes in Mammalian Cells.

用于在哺乳动物细胞中直接表达 PCR 扩增基因的新型终止子引物和增强剂试剂。

• DOI: 10.1007/s12033-015-9870-5
• 发表时间: 2015
• 期刊: Molecular Biotechnology
• 影响因子: 2.6
• 作者: Mikiko Nakamura;Ayako Suzuki;Junko Akada;Tohru Yarimizu;Ryo Iwakiri;Hisashi Hoshida;Rinji Akada
• 通讯作者: Rinji Akada

思い通りのＤＮＡデザインを目指した遺伝子操作技術と合成生物学

基因操作技术和合成生物学旨在根据需要设计 DNA

• 发表时间: 2015
• 作者: Mikiko Nakamura;Ayako Suzuki;Junko Akada;Tohru Yarimizu;Ryo Iwakiri;Hisashi Hoshida;Rinji Akada;中村美紀子
• 通讯作者: 中村美紀子