刺激に対する単一細胞の応答の顕微自動解析装置ーストップトフロ-法による即時反応解析の試み
单细胞对刺激反应的自动显微分析装置——使用停流法进行即时反应分析的尝试
基本信息
- 批准号:62870103
- 负责人:
- 金额:$ 22.53万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research
- 财政年份:1989
- 资助国家:日本
- 起止时间:1989 至 无数据
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
[目的]:本研究の目的は、顕微鏡下に捉えた単一培養細胞に、迅速に刺激物質(ホルモン、成長因子など)を投与し、その後の細胞の応答(特に、細胞内イオン濃度の変化)を実時間で検出・記録し、解析するシステムを開発することである。[現在までの進展状況]:(1)細胞内への蛍光色素の導入細胞内カルシウム濃度測定のためにはfura2が、細胞内pHの測定にはBCECFが従来から有効に使われてきた。本研究でもこれらの色素をいくつかの細胞に適用し、特にBCECFは細胞を選ばず高率よく染色できることを確認した。他方、この1-2年の間に、細胞内ナトリウムイオン濃度(SBFIなど)、カリウムイオン濃度(PBSIなど)マグネシウムイオン濃度(Mag-fura2など)、および塩化物イオン濃度(SPQなど)の変化に敏感に応答して蛍光スペクトルの変化する色素が開発・市販され、容易に使用できる状況になった。更に、可視光で使用できるカルシウムイオン蛍光試薬(fluo3など)も開発された。本研究で試作している装置は、これら続々と開発される試薬に即座に対応できるものである。新しい蛍光試薬SBFIとfluo3の細胞内への導入を試みた。SBFIはやや染色が悪いが、低濃度の界面活性剤を援用すると、高感度テレビカメラで単一細胞を画像として捉えるに充分な程度に染色可能であった。ヒト由来の培養細胞(Hella細胞)をSBFIで染色し、ウアバイン(ナトリウムポンプの阻害剤)を投与して、細胞内ナトリウムイオン濃度が瞬時に(<30秒)増大する過程を単一細胞レベルで記録可能であった。(2)flow法刺激投与の方法としては、細胞外液の迅速置き換えによる薬物投与法がもっとも汎用性が高い。しかしながら、薬物を迅速に投与しようとすると、液流の線速度を上げなければならない。基礎実験の過程で、以下のような現象が観察された。すなわち、カルシウム蛍光指示薬で染色した培養細胞の外液をfow法で(薬物を含まない)塩溶液で置き換えたところ、細胞内カルシウム濃度の一過性の上昇が観察された。この事実は、flow自身が副反応をひきおこす可能性があることを示すものである。液の流れ、あるいは単に機械的刺激だけで、細胞内カルシウム濃度が上昇することはそれ自身興味深い生理現象ではあるが、細胞へのリガンド結合による反応を浮き出させようともくろむ実験にとっては、都合が悪い。充分な基礎実験をして、流れ自身による副反応が懸念されるときは、時間分解を犠牲にする(流速を充分落とす)必要がある。(3)光学系と画像解析細胞内イオン濃度分布を画像化し、定量的に解析するためには、蛍光色素を2つの異なる波長で励起し、各々の励起波長に対する蛍光強度を記録する必要がある。蛍光強度を光電子増倍管で検出する方式ならば、技術的には全く問題がなく、ミリ秒スケ-ルでの計測が既に達成されている。本研究では、更に進んで、細胞内イオン濃度分布の変化を画像として連続的に記録することを目標にしている。現在のテレビジョン記録伝送方式に従うと、毎秒30画面、イオン濃度変化としては毎秒15画面のスピ-ドで記録可能となる。現在の装置の光源はチョッパ方式を採用したため、当初に予定した画像取り込み速度の1/2、即ち毎秒7.5画面に留まっている。光源の強さが特に紫外域において不足するという問題点もある。ビデオ同期2波長フラッシュによる解決を考慮している。
[Objective]: The purpose of this study was to detect, record and analyze the response of cultured cells to the administration of stimulating substances (including growth factors) under microscope, and to detect the response of cultured cells after the administration of stimulating substances (including intracellular concentrations). [Current status]:(1) Introduction of intracellular fluorescent pigments into cells. Determination of intracellular concentration. Determination of intracellular pH. In this study, we confirmed the high rate of staining in BCECF cells. Other methods, such as 1-2 years, intracellular concentration (SBFI), concentration (PBSI), concentration (Mag-fura2), and concentration (SPQ) are sensitive to changes in pigment development, marketing, and ease of use. In addition, visible light is used to test the development of light (fluo3). This study is intended to test the feasibility of the device. New light test SBFI and fluo3 for intracellular transfer SBFI can be used for both staining and low concentration of surfactant, high sensitivity, and cell imaging. When cultured cells (Hella cells) are stained with SBFI, their intracellular concentrations increase instantaneously (<30 seconds), and individual cell counts are recorded. (2) The method of stimulation and administration by flow method is highly versatile, and the rapid change of extracellular fluid is highly effective. The speed of liquid flow increases rapidly. The basic process of implementation, the following phenomena are observed. A transient increase in the concentration of the intracellular protein was observed in the culture medium of the cultured cells. The flow itself is a negative reaction. The fluid flow is caused by mechanical stimulation, and the intracellular concentration is increased. The flow rate is sufficient to satisfy the needs of the environment. (3)The optical system analyzes the distribution of intracellular concentrations in cells graphically and quantitatively. It is necessary to record the intensity of light at different excitation wavelengths. Light intensity is measured by means of an optoelectronic multiplier tube, and the measurement of light intensity is achieved by means of a complete set of problems and technologies. The aim of this study is to further characterize and record the distribution of intracellular concentrations. Now, the recording mode is changed to 30 frames per second, and the recording mode is changed to 15 frames per second. The light source of the present device is used in a predetermined manner, and the image is taken at a speed of 1/2, that is, 7.5 frames per second. The intensity of the light source is insufficient. 2-wavelength resolution
项目成果
期刊论文数量(2)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
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