刺激に対する単一細胞の応答の顕微自動解析装置ーストップトフロ-法による即時反応解析の試み

[目的]:本研究の目的は、顕微鏡下に捉えた単一培養細胞に、迅速に刺激物質(ホルモン、成長因子など)を投与し、その後の細胞の応答(特に、細胞内イオン濃度の変化)を実時間で検出・記録し、解析するシステムを開発することである。[現在までの進展状況]:(1)細胞内への蛍光色素の導入細胞内カルシウム濃度測定のためにはfura2が、細胞内pHの測定にはBCECFが従来から有効に使われてきた。本研究でもこれらの色素をいくつかの細胞に適用し、特にBCECFは細胞を選ばず高率よく染色できることを確認した。他方、この1-2年の間に、細胞内ナトリウムイオン濃度(SBFIなど)、カリウムイオン濃度(PBSIなど)マグネシウムイオン濃度(Mag-fura2など)、および塩化物イオン濃度(SPQなど)の変化に敏感に応答して蛍光スペクトルの変化する色素が開発・市販され、容易に使用できる状況になった。更に、可視光で使用できるカルシウムイオン蛍光試薬(fluo3など)も開発された。本研究で試作している装置は、これら続々と開発される試薬に即座に対応できるものである。新しい蛍光試薬SBFIとfluo3の細胞内への導入を試みた。SBFIはやや染色が悪いが、低濃度の界面活性剤を援用すると、高感度テレビカメラで単一細胞を画像として捉えるに充分な程度に染色可能であった。ヒト由来の培養細胞(Hella細胞)をSBFIで染色し、ウアバイン(ナトリウムポンプの阻害剤)を投与して、細胞内ナトリウムイオン濃度が瞬時に(<30秒)増大する過程を単一細胞レベルで記録可能であった。(2)flow法刺激投与の方法としては、細胞外液の迅速置き換えによる薬物投与法がもっとも汎用性が高い。しかしながら、薬物を迅速に投与しようとすると、液流の線速度を上げなければならない。基礎実験の過程で、以下のような現象が観察された。すなわち、カルシウム蛍光指示薬で染色した培養細胞の外液をfow法で(薬物を含まない)塩溶液で置き換えたところ、細胞内カルシウム濃度の一過性の上昇が観察された。この事実は、flow自身が副反応をひきおこす可能性があることを示すものである。液の流れ、あるいは単に機械的刺激だけで、細胞内カルシウム濃度が上昇することはそれ自身興味深い生理現象ではあるが、細胞へのリガンド結合による反応を浮き出させようともくろむ実験にとっては、都合が悪い。充分な基礎実験をして、流れ自身による副反応が懸念されるときは、時間分解を犠牲にする(流速を充分落とす)必要がある。(3)光学系と画像解析細胞内イオン濃度分布を画像化し、定量的に解析するためには、蛍光色素を2つの異なる波長で励起し、各々の励起波長に対する蛍光強度を記録する必要がある。蛍光強度を光電子増倍管で検出する方式ならば、技術的には全く問題がなく、ミリ秒スケ-ルでの計測が既に達成されている。本研究では、更に進んで、細胞内イオン濃度分布の変化を画像として連続的に記録することを目標にしている。現在のテレビジョン記録伝送方式に従うと、毎秒30画面、イオン濃度変化としては毎秒15画面のスピ-ドで記録可能となる。現在の装置の光源はチョッパ方式を採用したため、当初に予定した画像取り込み速度の1/2、即ち毎秒7.5画面に留まっている。光源の強さが特に紫外域において不足するという問題点もある。ビデオ同期2波長フラッシュによる解決を考慮している。

[目的]:本研究の目的は、顕微鏡下に捉えた単一培養細胞に、迅速に刺激物質(ホルモン、成長因子など)を投与し、その後の細胞の応答(特に、細胞内イオン濃度の変化)を実時間で検出・記録し、解析するシステムを開発することである。[現在までの進展状況]:(1)細胞内への蛍光色素の導入細胞内カルシウム濃度測定のためにはfura2が、細胞内pHの測定にはBCECFが従来から有効に使われてきた。本研究でもこれらの色素をいくつかの細胞に適用し、特にBCECFは細胞を選ばず高率よく染色できることを確認した。他方、この1-2年の間に、細胞内ナトリウムイオン濃度(SBFIなど)、カリウムイオン濃度(PBSIなど)マグネシウムイオン濃度(Mag-fura2など)、および塩化物イオン濃度(SPQなど)の変化に敏感に応答して蛍光スペクトルの変化する色素が開発・市販され、容易に使用できる状況になった。更に、可視光で使用できるカルシウムイオン蛍光試薬(fluo3など)も開発された。本研究で試作している装置は、これら続々と開発される試薬に即座に対応できるものである。新しい蛍光試薬SBFIとfluo3の細胞内への導入を試みた。SBFIはやや染色が悪いが、低濃度の界面活性剤を援用すると、高感度テレビカメラで単一細胞を画像として捉えるに充分な程度に染色可能であった。ヒト由来の培養細胞(Hella細胞)をSBFIで染色し、ウアバイン(ナトリウムポンプの阻害剤)を投与して、細胞内ナトリウムイオン濃度が瞬時に(<30秒)増大する過程を単一細胞レベルで記録可能であった。(2)flow法刺激投与の方法としては、細胞外液の迅速置き換えによる薬物投与法がもっとも汎用性が高い。しかしながら、薬物を迅速に投与しようとすると、液流の線速度を上げなければならない。基礎実験の過程で、以下のような現象が観察された。すなわち、カルシウム蛍光指示薬で染色した培養細胞の外液をfow法で(薬物を含まない)塩溶液で置き換えたところ、細胞内カルシウム濃度の一過性の上昇が観察された。この事実は、flow自身が副反応をひきおこす可能性があることを示すものである。液の流れ、あるいは単に機械的刺激だけで、細胞内カルシウム濃度が上昇することはそれ自身興味深い生理現象ではあるが、細胞へのリガンド結合による反応を浮き出させようともくろむ実験にとっては、都合が悪い。充分な基礎実験をして、流れ自身による副反応が懸念されるときは、時間分解を犠牲にする(流速を充分落とす)必要がある。(3)光学系と画像解析細胞内イオン濃度分布を画像化し、定量的に解析するためには、蛍光色素を2つの異なる波長で励起し、各々の励起波長に対する蛍光強度を記録する必要がある。蛍光強度を光電子増倍管で検出する方式ならば、技術的には全く問題がなく、ミリ秒スケ-ルでの計測が既に達成されている。本研究では、更に進んで、細胞内イオン濃度分布の変化を画像として連続的に記録することを目標にしている。現在のテレビジョン記録伝送方式に従うと、毎秒30画面、イオン濃度変化としては毎秒15画面のスピ-ドで記録可能となる。現在の装置の光源はチョッパ方式を採用したため、当初に予定した画像取り込み速度の1/2、即ち毎秒7.5画面に留まっている。光源の強さが特に紫外域において不足するという問題点もある。ビデオ同期2波長フラッシュによる解決を考慮している。