リボソームストークをハブとする翻訳関連因子プールの機能動態解明

本研究ではリボソームと翻訳因子の結合・解離サイクルを駆動するリボソームストークをハブとして形成される翻訳因子プールについて、その構成因子を明らかにする。また各因子とストークの結合・解離動態を明らかにする。2023年度は (a) コントロールとして用いるMBP 安定発現細胞の作製と (b) 近位依存ビオチン標識タンパク質の濃縮および質量分析によるビオチン標識タンパク質の同定を行った。(a) Flp-In 293細胞を親株とし、近位依存ビオチン標識法のコントロールとして用いるMBP-uID安定発現細胞を樹立した。昨年度樹立したP0-uID発現細胞株と同様、ドキシサイクリン依存的に細胞質でMBP-uIDの発現が誘導され、ビオチン依存的に細胞中のタンパク質がビオチン標識されることを確認した。(b) P0-uID発現細胞とMBP-uID発現細胞のそれぞれで近位依存ビオチン標識を行い、化学修飾によりトリプシン耐性をもたせたストレプトアビジンビーズを用いてビオチン標識タンパク質を濃縮後、トリプシン消化によってビオチン標識タンパク質由来のペプチドを溶出した。LC-MS/MSとMaxQuantソフトウェアを用いて、各サンプルからビオチン標識されたと予想されるタンパク質を同定した。3 biological replicatesを用いた解析から、P0-uIDで標識されたタンパク質を120種類、MBP-uIDで標識されたタンパク質を218種類同定した。P0-uIDで最も標識されたタンパク質はP0、MBP-uIDで最も標識されたタンパク質はMBPであった。P0-uIDによる近位依存ビオチン標識実験では、リボソームストークと直接結合することが知られている既存の翻訳因子がすべて検出されたことから、確立した実験手法によりリボソームストーク近傍に存在するタンパク質を同定できていることが期待された。

本研究ではリボソームと翻訳因子の結合・解離サイクルを駆動するリボソームストークをハブとして形成される翻訳因子プールについて、その構成因子を明らかにする。また各因子とストークの結合・解離動態を明らかにする。2023年度は (a) コントロールとして用いるMBP 安定発現細胞の作製と (b) 近位依存ビオチン標識タンパク質の濃縮および質量分析によるビオチン標識タンパク質の同定を行った。(a) Flp-In 293細胞を親株とし、近位依存ビオチン標識法のコントロールとして用いるMBP-uID安定発現細胞を樹立した。昨年度樹立したP0-uID発現細胞株と同様、ドキシサイクリン依存的に細胞質でMBP-uIDの発現が誘導され、ビオチン依存的に細胞中のタンパク質がビオチン標識されることを確認した。(b) P0-uID発現細胞とMBP-uID発現細胞のそれぞれで近位依存ビオチン標識を行い、化学修飾によりトリプシン耐性をもたせたストレプトアビジンビーズを用いてビオチン標識タンパク質を濃縮後、トリプシン消化によってビオチン標識タンパク質由来のペプチドを溶出した。LC-MS/MSとMaxQuantソフトウェアを用いて、各サンプルからビオチン標識されたと予想されるタンパク質を同定した。3 biological replicatesを用いた解析から、P0-uIDで標識されたタンパク質を120種類、MBP-uIDで標識されたタンパク質を218種類同定した。P0-uIDで最も標識されたタンパク質はP0、MBP-uIDで最も標識されたタンパク質はMBPであった。P0-uIDによる近位依存ビオチン標識実験では、リボソームストークと直接結合することが知られている既存の翻訳因子がすべて検出されたことから、確立した実験手法によりリボソームストーク近傍に存在するタンパク質を同定できていることが期待された。